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摘要:目的:观察肝必康胶囊对乙肝病毒的抑制作用。方法:采用HepG2.2.15细胞的培养,MTT比色法检测药物对细胞的毒性,定量PCR检测HBV―DNA,ELISA法检测HBsAg、HBeAg的含量,研究肝必康胶囊对HepG 2.2.15细胞的毒性,HBsAg与HBeAg表达及HBV―DNA含量的影响。结果:肝必康半数细胞毒浓度(TC50)为4.677mg/mL,最大无毒浓度(TG)为0.118mg//mL。各组在用药后72、144 h细胞上清中HBV DNA拷贝数降低,肝必康在0.1 mg/mL时抑制率最高。各组用药后细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg浓度显著降低。肝必康在0.1 mg/mL时抑制率最高。肝必康各组含药血清在用药后72、144 h细胞上清中HBsAg和HBeAg浓度显著降低,高剂量组抑制率最高。显示明显抗HBV的作用,TI均大于2。结论:肝必康胶囊体外培养细胞实验证实其有较强的抗乙肝病毒作用,且毒性较低。
关键词:肝必康胶囊;HepG 2.2.15细胞;乙型肝炎表面抗原(HBSAg);乙型肝炎e抗原(HBeAg);乙型肝炎病毒DNA(HBV―DNA)
中图分类号:R285.5 文献标识码:A
文章编号:1007―2349(2010)11―0053―03
乙型肝炎是由HBV引起的,以肝脏炎性病变为主的一种传染性疾病。尽管已有干扰素及核苷类等各种抗病毒药物,但其疗效均不理想。目前中草药抗病毒己成为国内外的研究热点。肝必康胶囊系本院研制的纯中药抗肝炎制剂,由三叶香茶菜、甜茶藤、溪黄草、灵芝等10味中草药组成,具有清热解毒,利湿退黄,保肝降酶等作用。临床上用于乙肝病毒引起的急、慢性肝炎和黄疸等症效果良好。笔者前期进行了肝必康胶囊药效学研究工作,证实其具有抗肝损伤及免疫增强作用。本文采用HepG 2.2.15细胞培养及中药血清药理学方法,研究了肝必康胶囊在2215细胞培养中对乙型肝炎病毒细胞毒性,HBsA g,HBeAg浓度和HBV DNA含量的抑制作用,现报道如下。
1 实验材料
1.1 受试药物肝必康胶囊(以下简称肝必康)由广西中医药研究院提供。实验时用蒸馏水配制成所需浓度的药液供动物灌胃用。阿昔洛韦(ACV):湖南迪诺制药有限公司医药工业研究所生产,批号:20060829。拉米夫定(3TC):贺普丁片,葛兰素史克制药(苏州)有限公司生产,批号:200600604。
1.2 主要试剂RPMI 1640培养基:美国Gibco公司,批号13200―035。胎牛血清(FBS):美国Gibco公司,批号16000―036。四甲基偶氮唑盐(MTT):美国Sigma公司,批号35441304。G418:美国Sigma公司,批号108321―42―2。Taq酶、dNTP=美国MBI公司。HBV DNA荧光定量PCR试剂盒:深圳匹基生物工程股份有限公司。ALT,AST改良赖式法检测试剂盒:四川省迈克科技有限责任公司。HbsA g,HBeAg酶联免疫检测试剂盒:上海荣盛生物技术有限公司。
1.3 细胞株HepG2.2.15细胞株,购自北京医科大学第一附属医院病毒研究所,本室自行传代,定期用G418筛选。
1.4 主要仪器美国MJ PTC―220实时荧光定量PCR仪:Bio―Rad公司。iCycler iQCO2孵箱:美国Thermo Forma公司。XD一101型酶标仪:bio―rad公司。
1.5 实验动物
Wistar大鼠,体重(250±20)g,雌雄各半,SPF级;实验动物使用许可证号:SYKG桂2003―0005;实验动物生产许可证号:SCXKG桂2003―0003。由广西医科大学实验动物中心提供。
1.6 统计方法采用SPSS 10.0统计软件分析数据,组间比较采用方差分析,各均数两两比较。
2 实验方法
2.1 HepG2.2.15细胞的培养HepG 2.2.15细胞为贴壁生长细胞,用RPMI 1640培养基传代培养,每2 d换液,约5 d消化传代1次,传代按下列步骤操作:吸去长满HepG 2.2.15细胞的培养瓶中培养液,以D―Hank"s液洗2次,加入2 m10.25%的胰酶消化液,37℃约5 min,加入完全培养液,吹打后低速离心5 min,吸去上清,加人完全培养液反复吹打,将细胞吹打均匀,1:3传代。消化后加入细胞计数板计数,将细胞浓度调至3×104个/mL,接种于细胞培养板,24孔及96孔培养板每孔分别接种1000 μL和100μL,5%CO2,37℃,培养24 h,细胞长成单层后进行实验。
2.2 药培养液配制
将肝必康以新鲜三蒸水配成500mg/mL的母液,经0.45,am的微孔滤膜,再经0.22 am微孔滤膜过滤除菌后,置4℃冰箱保存备用,实验时用完全培养液将肝必康系列5倍稀释成6个终浓度为:200、40、8、1.6、0.32、0.064 mg/mL的应用液。
2.3 含药血清的制备采用血清药理学方法进行实验,制备血清方法如下:3月龄Wistar大鼠50只,雌雄各半,体重(250±20)g,随机分为5组,每组10只。①正常血清对照组:等量的生理盐水;②阳性药物对照组:阿昔洛韦,0.1 mg/kg/d;②肝必康大剂量组:1.5粒/kg/d;③肝必康中剂量组:1.0粒/kg/d;④肝必康小剂量组:0.5粒/kg/d。各组动物在同样条件下饲养,均以每日2次,早晚各1次空腹灌胃连续给药7d。于最后1次灌胃(灌胃前禁食不禁水12 h)后2 h,乙醚吸入麻醉,腹主动脉抽血,离心分离血清,并将每组动物的血清混合。经56℃30 min灭活处理,经0.45μm的微孔滤膜,再经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后,置-20℃冰箱保存备用。
2.4 细胞存活率的测定根据Mosmann建立的MTT比色法检测药物对细胞的毒性,稍加改进。①将HepG2.2.15细胞经胰蛋白酶消化后,用完全培养液将细胞浓度调至2×104/mL细胞悬液,加入96孔培养板中,每孔100μL,每个浓度设6个复孔,置CO2孵箱(37℃,5%CO2)中培养。②24 h后细胞贴壁且生长良好,吸除全部培养液,用6个终浓度(200、40、8、1.6、0.32、0.064 mg/mL)的肝必康应用液。③连续培养72 h,培养结束前4 h,每孔加入MTT10 μL,于37℃培养箱中继续培养。④4 h后小心吸弃上清后,每孔加二甲亚砜(DMSO)100止,微量振荡器振荡5 miD,使结晶紫完全溶解。在自动酶标仪比色(检测波长570 nm,参考波长630 rim),测吸光度(OD),记录结果。⑤计算药物对HepG 2.2.15细胞的抑制百分率并按Reed-Muench法计算半数细胞毒浓度(TCso)和最大无毒浓度(TC。)。
2.5 肝必康抗乙肝病毒活性测定
2.5.1 样品制备①将HepG 2.2.15细胞经胰蛋白酶消化后,用完全培养液将细胞浓度调至2×104/mL细胞悬液,加入24孔培养板中,每孔 500μL,每个浓度设2个复孔,置CO2孵箱(37℃,5%CO2)中培养。②24 h后细胞贴壁且生长良好,吸除全部培养液,加入肝必康药物浓度分别为:0.4、0.2、0.1、0.25、0.125 g/mL以及含药血清(浓度均为10%)配制的完全培养液各1000μL,每个浓度3个复孔。置CO2孵箱(37℃,5%CO2)中培养。以等量的完全培养液为阴性对照,以征实有效的拉米夫定(3TC:0.2、0.1、0.05 g/mL)为阳性对照。③连续培养72 h后,分别吸出培养液于1.5 mL。灭菌Ep―pendorf管中,-20℃保存备用。再次加入上述含不同浓度药物的培养液培养。④继续培养72 h后,分别吸出培养液于1.5 mL.灭菌Eppendorf管中,-20℃保存备用。
2.5.2 定量PCR检测HBV DNA A、HBV―DNA模板的制备:①取上述上清液及试剂盒中的对照品各100μL,分别加到0.5 mL离心管中;②加入100“L DNA提取液1,振摇混匀,13000 rpm离心10min;③吸弃上清(离心时注意固定离心管方向,尽可能吸弃上清且不碰沉淀);④再加入25μL DNA提取液2,振摇混匀,2000 rpm离心10secl⑤100。C干浴或沸水浴10 min;⑥13000 rpm离心10 min,吸取上清液保留备用。B、HBV DNA定量标准品:由深圳匹基公司直接提供,分别为5×104、5×105、5×106、5×107拷贝/mL。C、FQ―PCR反应体系:按试剂盒要求建立FQ―PCR反应体系,每个样品定量PCR反应体系包括:定量PCR混合液38.0μL(包括PCR反应液37.6 μL,Taq酶0.4μL,UNG 0.06μL),血清提取物2 μL,并同时设立阴性对照、临界阳性对照和强阳性对照。即保证所有反应体系的组成(如酶浓度、引物浓度等)一致。D、FQ―PCR反应条件:将上述成分充分混匀后,于荧光定量PCR仪上按以下条件进行PCR扩增:94℃预变性1 min;95℃变性5 s,60℃退火、延伸20 s。共反应42个循环。E、FQ―PCR的结果判读:扩增过程及荧光信号检查、数据的储存和分析均由仪器及自带的软件自动完成。
2.5.3 ELISA法检测HBsA g,HBeAg方法同2.5.1。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测HBsAg和HBeAg效价。结果以抑制率表示,药物对抗原的抑制百分率(%)=[1一实验孔抗原OD值/对照孔抗原OD值1×100%,并按Reed―Muench法计算半数抑制浓度(IC50)。
2.5.4 药效评价一般用治疗指数(TI)值来评价药物的临床应用前景。TI=TO0/IC0,TI>2为药物有效低毒.10=0.118 mg/mL,即当肝必康给药剂量≤0.118 mg/mL时肝必康对HepG 2 2.2.15细胞没有毒性。结果见表1。
3.2 肝必康在HepG2.2.15细胞系培养中对HBV的抑制作用与空白对照组比较,各组在用药后72、144 h细胞上清中HBV DNA拷贝数降低,肝必康在0.1 mg/mL时抑制率最高。结果见表2。
3.3 肝必康含药血清在HepG 2.2.15细胞系培养中对HBv的抑制作用与空白对照组比较,肝必康高、中、低剂量组含药血清在用药后72、144 h细胞上清中HBV DNA拷贝数均有显著降低,其中肝必康高剂量组抑制率最高。结果见表3。
3.4 肝必康在HepO 2.2.15细胞系培养中对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用与空白对照组比较,各组用药后细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg浓度显著降低。肝必康在0.1 mg/mL时抑制率最高。与DNA下降结果一致。结果见表4。
3.5 肝必康含药血清在HepG 2.2.15细胞系培养中对HB―sag和HBeAg表达的抑制作用与空白对照组比较,肝必康各组含药血清在用药后72、144 h细胞上清中HBsAg和HBeAg浓度显著降低。其中肝必康高剂量组抑制率最高。结果见表5。
3.6 肝必康对HBeAg和HBsAg的Ic5c及TI肝必康具有明显抗HBV的作用,TI均大于2,呈现高效低毒的特点。结果见表6。
4 小结
HBV―DNA克隆转染人肝癌细胞2215细胞系是体外筛选抗乙肝病毒药物的有效方法。本实验采用HepG 2.2.15细胞模型和中药血清药理学方法。
采用HepG 2.2.15细胞的培养,MTT比色法检测药物对细胞的毒性,定量PCR检测HBV―DNA,EusA法检测HBsA g,HBeAg的含量。实验结果表明,肝必康半数细胞毒浓度(TG50)为4.677 mg/mL,最大无毒浓度(TG)为0.118 mg/mL。各组在用药后72、144 h细胞上清中HBVDNA拷贝数降低,肝必康在0.1 mg/mL时抑制率最高。各组用药后细胞培养上清液中的HicksAg和HBeAg浓度显著降低。肝必康在0.1 mg/mL时抑制率最高。与DNA下降一致。肝必康各组含药血清在用药后72、144 h细胞上清中HBsag和HBeAg浓度显著降低,高剂量组抑制率最高。肝必康具有明显抗HBV的作用,TI均大于2,呈现高效低毒的特点。肝必康能显著抑制HepG 2.2.15细胞株内HBV的复制,且呈现高效低毒的特点。因而认为,肝必康是一种有效的抗HBV、治疗乙型肝炎的药物。
