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摘要：从宜昌部分地区猪散养户中随机抽取部分猪血样及疑似高致病性猪蓝耳病病例血样共计１８１份，进行高致病性猪蓝耳病ＲＴ－ＰＣＲ的检测，结果显示２３份为阳性。试验初步证明，随机抽取的１８１头猪中有部分猪感染高致病性猪蓝耳病病原。
关键词：高致病性猪蓝耳病；ＲＴ－ＰＣＲ；检测
中图分类号：Ｓ８５８．２８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７－２７３Ｘ（２０12）05-0012-01
高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。该病最早于１９８７年报道于美国南部，现已遍及世界各地，给全球养猪业造成了巨大的经济损失［１］。
２００６年，我国暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的“猪高热综合征”［２］。宜昌地区也暴发了“猪高热综合征”，给当地养殖行业造成了巨大损失。后经诊断为多病原混合感染，其中主要的病原就是高致病性猪蓝耳病病原。本试验就是从当地养殖场随机抽取血样进行高致病性猪蓝耳病病原学检测，为高致病性猪蓝耳病的预防和预警打下坚实基础。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
（１）猪全血。从宜昌部分猪场随机抽取１８１份全血，编号为１－１８１。
（２）高致病性猪蓝耳病阳性血清。
（３）引物。参照李彬等［２］的论文设计１对特异性引物。上游引物（Ｎｓｐ２Ｆ）序列为５’－ＴＧＧＧＣＧＡＣＡＡＴＧＴＣＣＣ－３’，下游引物（Ｎｓｐ２Ｒ）序列为５’－ＧＣＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＧＧＧＣＧ－３’。ＰＲＲＳＶ变异株和经典毒株预期扩增产物长度分别为４１８ｂｐ和５０８ｂｐ。
（４）主要试剂。ＲＮＡ提取试剂盒为美国ＯＭＥＧＡ公司产品；ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒为大连宝生物公司产品；低分子量蛋白质Ｍａｒｋｅｒ、琼脂糖为ＯＸＯＩＤ产品。
１．２ 试验方法
１．２．１ 病毒总ＲＮＡ的提取 采集的全血分离后收集血清，ＲＮＡ的抽提按试剂盒说明书进行。
１．２．２ 反转录反应 按ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ） Ｖｅｒ ３．０ 说明书进行。反转录产物直接用于ＰＣＲ 反应模板或－２０℃保存。
１．２．３ ＰＣＲ反应 反转录产物１０μＬ，５×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １０．０ μＬ，上下游引物各０．５μＬ（２０μｍｏｌ／Ｌ），ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ ０．２５μＬ（５ Ｕ／μＬ），用灭菌双蒸水补充总体积至５０μＬ。ＰＣＲ 反应条件为：９４℃ ５ ｍｉｎ变性；９４℃ １ ｍｉｎ，５７℃ １ ｍｉｎ，７２℃ １ ｍｉｎ，３５循环；７２℃ 延伸 １０ ｍｉｎ，４℃保存。
１．２．４ ＰＣＲ产物电泳检测 ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶上进行电泳，当溴酚蓝电泳至适当位置，在长波紫外灯凝胶成像系统下观察或拍照。
２ 结果
２．１ 高致病性猪蓝耳病ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果
提取总ＲＮＡ，ＲＴ－ＰＣＲ扩增，产物经１％琼脂糖凝胶电泳，阳性对照获得大小为４１８ｂｐ左右的片段，与设计长度一致。部分上样孔在４１８ｂｐ左右有带（图１）。
本试验共采集样本１８１份进行高致病性猪蓝耳病ＲＴ－ＰＣＲ的检测，结果显示２３份为阳性。
２．２ 重复性试验
全部材料重复检测一次，结果一致。
３ 讨论
猪繁殖与呼吸综合征是２０世纪８０年代后期在美国暴发的一种新型猪病毒性传染病，给全世界养猪业造成了巨大的损失。以高致病性猪蓝耳病为主要病原的高热病席卷了我国南方多个省市，并以高热、高发病率、高死亡率为主要特征，重创了我国养猪行业。
近年来，宜昌市动物疫情时有发生，特别是高致病性猪蓝耳病给宜昌市畜牧业造成了一定的负面影响，为了更好地加强宜昌市动物疫病的防控能力，提高对重大动物疫病的预警、预报和诊断能力，笔者参考文献［２］，建立了用ＲＴ－ＰＣＲ方法诊断高致病性猪蓝耳病技术。该技术具有特异性和敏感性高、操作简便、快速高效等特点，并且能区别高致病性猪蓝耳病和普通蓝耳病，为疫病的确诊提供了有力保障。
参考文献：
［１］ 方六荣．猪繁殖与呼吸综合征“自杀性”ＤＮＡ疫苗与活病毒载体疫苗研究［Ｄ］．武汉：华中农业大学，２００３.
［２］ 李 彬，刘苏燕，赵付伟，等． 猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立与应用［Ａ］． 第１０届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集［Ｃ］． 武汉：２００９．
