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【摘要】 目的 从分子生化水平上对田间农艺性状表现差异的6种类型盾叶薯蓣进行比较分析。方法 采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对6种类型盾叶薯蓣的叶片进行过氧化物酶(POD)同工酶测定。结果 POD同工酶在不同类型盾叶薯蓣间有所不同。根据酶带的分离结果，可将此6种类型大致划分为三大类，即有花纹大三角叶型(A)与无花纹大三角叶型(B)为一类；有花纹小三角间心形叶型(E)与无花纹心形叶型(D)、无花纹小三角间心形叶型(F)为一类；有花纹心形叶型(C)为单独一类。结论 根据酶带分布差异的分析结果，可以初步对形态表现不同的盾叶薯蓣加以归类。同工酶电泳分析方法可作为薯蓣选种研究的辅助工具。
【关键词】盾叶薯蓣；过氧化物酶(POD)同工酶；电泳
Analysis of differences of six different types of Dioscorea zingiberendid C.H.Wright on the molecule biochemistry level
LI Juan,XIAO Jie-yi,HAN Feng,et al.The Research Institute of Medicine Plantation of Chongqing,Nanchuan,Chongqing 408435,China
【Abstract】 Objective To analyze the differences of six different types of Dioscorea zingiberendid C.H.Wright on the molecule biochemistry level.Methods The POD isoenzyme analysis in leaves on six different types of Dioscorea zingiberendid C.H.Wright was carried out with vertical slab polyacrylamide gel electrophoresis technique.Results The results indicated:six types of Dioscorea zingiberendid C.H.Wright can be compartmentalized 3 groups,A and B can be considered as a genre,D and E,F can be considered as another genre,and C can be considered as a separate genre.Conclusion From the analysis of the POD isoenzyme belts distributing,we can categorize the sixdifferent types preliminarily.And the technique of isoenzyme analysis can be applied in the seed selecting studies of Dioscorea zingiberendid C.H.Wright.
【Key words】Dioscorea zingiberendid C.H.Wright； POD isoenzyme；Electrophoresis
盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberendid C.H.Wright)又名黄姜，为薯蓣科薯蓣属多年生缠绕草质藤本植物，其根状茎内的薯蓣皂素含量最高可达16．15％，是目前世界上用于合成甾体激素类药物的重要药源植物[1，2]。根据国内生物技术及医药产品开发的现状和国际生物医药的应用前景，盾叶薯蓣有较广泛的用途、利用价值极高，我国十分重视其生产与有效生物活性成分的开发研究，并将其列为国家生物医药工程发展的重点项目之一。
但生产中，薯蓣是一个多类型的混合群体，它对经济产量的形成和内在皂素含量影响较大[3]，因此在薯蓣混合群体中选出产量和皂素含量高的类型至关重要。为此，特应用过氧化物酶同工酶的化学测定方法，对盾叶薯蓣不同类型进行测定分析比较，拟找出它们的区别点，为薯蓣选种研究提供可靠的科学依据，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1．1 材料来源 在薯蓣植株生长旺盛期，于2005年6月中旬，将重庆市卫生局重点项目《盾叶薯蓣选种研究》课题组，在南川区三泉镇三泉村一社的人民坝布置的薯蓣试验田内，选取有花纹大三角叶形(代号：A)、无花纹大三角叶形(代号：B)、有花纹大心形间三角叶形(代号：C)、无花纹大心形间三角叶形(代号：D)、有花纹小三角叶形(代号：E)、无花纹小三角叶形(代号：F)等6个类型植株中部的多张叶片，随即分别装入冰瓶内，带回室内处理，待进行过氧化物酶同工酶的测定分析。
1．2 实验方法
1．2．1 酶液的制备 将从田间取回的薯蓣植株新鲜叶片，用蒸馏水洗净并吸干水分，各称取2 g加Tris-HCl(pH 8．2)缓冲液5 ml，于冰浴中充分研磨成匀浆，低温下3 500 r/min离心15～20 min，取上清液即过氧化物酶同工酶的粗提液，加少量40％蔗糖混合均匀，置冰箱中冷藏备用。
1．2．2 电泳 采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为7．5％(pH 8．9)，浓缩胶浓度为3％(pH 6．7)，电极缓冲液为pH 8．3的Tris-Gly缓冲液。每孔点样量为50 μl，加入几滴溴酚兰指示电泳前沿。于4℃冰箱内恒压电泳，浓缩胶中为112 V，待示踪指示剂进入分离胶后增大至210 V，电泳约需3．5 h。
1．2．3 染色 醋酸-联苯胺染色法染色[4]。经染色胶板上出现棕褐色清晰酶带，用蒸馏水漂洗后置7．5％冰醋酸中脱色、固定，照相、作图并按Rf＝酶带迁移距离/指示剂迁移距离，记录Rf值[5]。
2 结果与分析
6种类型盾叶薯蓣的过氧化物酶同工酶(POD)的电泳图谱见图1。由图可见，酶带的分离从负极到正极可依次划分为3个区域，即慢带区a、中快区b和快带区c。a区只分离出1条酶带(Rf＝0．014)，为6种类型所共有，且活性大小均一致。b区酶带的分离较丰富，共显现b1～b11等11条酶带，Rf从0．116～0．435，其中除Rf 0．116为六者共有酶带外，其余酶带的分布在不同类型薯蓣间有所不同：A、B两种类型薯蓣的酶带在这一区段较其余4种类型薯蓣的要多，尤以B类型突出(共检测出9条酶带)，说明A、B类型薯蓣体内的生长代谢较旺盛，相应需要较多的酶参与正常的代谢调控；除C类型外，其他5种类型薯蓣还共有酶带b2(Rf＝0．157)、b5(Rf＝0．222)、b8(Rf＝0．370)3条酶带，说明这3条酶带在薯蓣的生长发育有重要作用。c区也只分离出一条酶带(Rf＝0．685)，且只为C类型薯蓣所特有，其余5种类型在这一区段均不见有酶带显现，说明C类型与其余5种类型的遗传差异较大。在所有的分离酶带中，a1(Rf＝0．014)和b1(Rf＝0．116)为6种类型薯蓣的共有酶带，说明这2条酶带在薯蓣的生长发育代谢中起着必不可少的调控作用。
3 讨论与结论
同工酶是基因表达的产物，其表现的差异在一定程度上反映了基因的差异，从而可将同工酶作为种内或种间鉴别的辅助工具。从6种类型薯蓣同工酶的电泳分析可以看出，不同形态类型的薯蓣在同工酶的表达上存在差异。
C类型在酶带的分离上与另外5种类型薯蓣的差异较大，从电泳结果可见，快带区只分离出1条酶带c1(Rf＝0．685)，且为C类型所特有，可将其单独列为一种类型加以选育。类型A、B的电泳结果较相似，共有酶带为7条，说明二者的遗传背景较相似，故体内代谢也较一致；B类型相对A类型多出b4(Rf＝0．204)、b6(Rf＝0．241)和b9(Rf＝0．389)3条酶带。类型D和F的分离酶带完全一致，除个别酶带着色深浅有细微的差别外，酶带数目及迁移率均一致，说明这两种类型来自于同一个遗传组，只是由于二者在适应不同原生态环境条件时，体内代谢活跃程度略有差异，相应参与代谢调控的酶活性也有所不同，可将二者归为一类加以选育。E和D、F类型相比，三者分离酶带数均为5条，其中共有酶带为4条，即酶带a1(Rf＝0．014)、b1(Rf＝0．116)、b5(Rf＝0．222)和b8(Rf＝0．370)，E类型特有b7(Rf＝0．343)，D、F则特有b2(Rf＝0．157)，说明E和D、F也有较相似的遗传背景。
实验结果表明，所取6种不同类型盾叶薯蓣的样品，经多次重复测试分析，其总趋势是一致的，可划分为3组，即A与B为同一类型；C为单独类型； E与D、F为同一类型。本项测定分析，为选种研究奠定了坚实基础，可根据薯蓣的农艺性状、并结合田间抗性、产量及皂素含量情况，权衡几者的相关性，筛选出综合性状最佳类型，培育良种应用于生产，其意义是较大的。
参考文献
1 林向阳，任凤莲.盾叶薯蓣中薯蓣皂甙元的提取研究进展.河北科技师范学院学报，2005，19(3)：72-75.
2 丁志尊，唐世蓉，秦慧贞，等.甾体激素药源植物.科学出版社，1983.
3 李朝阳，杨朝霞，陈功锡，等.不同居群盾叶薯蓣生长、叶形态及皂苷元含量的研究.生命科学研究，2003，7(1)：58-64.
4 胡能书，万贤国.同工酶技术及其应用.湖南科技出版社，1985：74-75.
5 张相歧.番茄属四个种的过氧化物酶同工酶的分析.植物研究，1987，(4)：131-136.
