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（1.哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076；� 2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076）��
摘 要：将提取的羊栖菜多糖Sevage法除蛋白、H�2O�2脱色后得到羊栖菜多糖半纯品，依次通过DEAE-52、Sephadex G-200柱层析分离纯化后得到SFPS-B1。用原子力显微镜（AFM）对羊栖菜多糖（SPFS-B1）的微观结构进行观察。羊栖菜多糖（SPFS-B1）分子的稀溶液铺展在新鲜解理Ni��2＋�处理的云母片上，经干燥，乙醇固定后，获得稳定、重复的图像。羊栖菜多糖（SPFS-B1）分子具有高度分枝的结构，并且糖链间形成环状、柱状或近似于螺旋状的结构。羊栖菜多糖（SPFS-B1）链呈多股紧密的螺旋结构，这种现象可能与该多糖中分子间的Van der Waals相互作用以及糖链间氢键缔合有关。�
关键词：原子力显微镜；羊栖菜多糖；螺旋结构�
中图分类号：R915；R917文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）10-0012-02
生命中的螺旋结构现象可能具有普遍性，除蛋白质、核酸、脂类等生物分子都存在螺旋结构外［1，2］，多糖的螺旋状结构也有报道［3，4］，但羊栖菜多糖是否也存在螺旋状结构至今尚未见报道。由于多糖相对分子质量较大，结构复杂，自身常存在结构缺陷，从而难以得到良好的晶形，原子力显微镜（�Atomic Force Microscope，AFM）的出现，使得对多糖这样的生物大分子表面形貌的观察成为可能［5，6］。我们用AFM直接观察羊栖菜多糖的微观结构，获得了较清晰、重复性好的分子链结构影像，这为深入研究生物组织的微观结构和揭示生命规律，提供了重要依据。�
1 材料与方法�
1.1 材料与仪器�
DEAE-52（Pharmacia），Sephadex G-200（Pharmacia），羊栖菜购自哈尔滨市药材公司，并经哈尔滨师范大学生物系鉴定。�
Adventurer万分之一电子天平（OHAUS公司），旋涡混合器（美国BohemiaNY公司），AJ-Ⅲ型原子力显微镜（爱建纳米）。�
1.2 羊栖菜多糖的分离纯化�
取一定量的羊栖菜多糖配制成一定质量浓度的多糖水溶液，加入氯仿、正丁醇（5：1），剧烈震荡20min，混匀，离心（10min，3000r）。除去水相与有机相间的蛋白，水相仍按照此方法反复除蛋白6次后，氨水调节pH值8~9，加入10%左右的H�2O�2放入冰箱保鲜层过夜，流水透析72h，蒸馏水透析24h，减压浓缩后，加入4倍体积的无水乙醇，充分震摇于4℃静置24h，弃上清，沉淀以无水乙醇、丙酮洗涤，备用。�
1.3 DEAE-52纤维素柱层析�
所得羊栖菜多糖进行DEAE-52（2.6×55cm）柱层析，用0.05mol/LNaCl洗脱，自动部分收集器收集洗脱液，苯酚硫酸法隔管检测，流水透析至无Cl-后，冷冻干燥得SFPS-B。�
1.4 Sephadex G-200凝胶过滤柱层析�
取SFPS-B分别溶于少量水中，进行Sephadex G-200（1.6×80cm）柱层析，以0.02mol/L的NaCl洗脱，自动部分收集器收集洗脱液，苯酚硫酸法隔管检测，合并单一峰，分别得到SPFS-B1、SFPS-B2部分。将SFPS-B1、SFPS-B2流水透析至无Cl-后冷冻干燥。得洗脱部分SFPS-B1，本研究对SFPS-B1进行AFM观察。�
1.5 AFM制样�
把SFPS-B1（1mg/mL）溶于去离子蒸馏水中，冷至室温，再稀释，加热溶解，冷却，直至样品浓度为0.01mg/mL。通过加热使样品溶解完全且减少大聚集体的存在，取5μL多糖溶液（0.01mg/mL）滴在新鲜解理的云母片上，空气中干燥10min，大量水冲洗去没有吸附的残留物，再滴加无水乙醇固定，为防止多糖从云母表面脱附，样片干燥后即可进行AFM测量。�
2 实验结果�
2.1 栖菜多糖DEAE-52�
纤维素柱层析如图1所示，样品洗脱峰为单一对称峰，流水透析至无Cl-后，冷冻干燥得SFPS-B。�
图1 NaCl洗脱曲线
2.2 羊栖菜多糖SPFS-B Sephadex G-200凝胶过滤柱层析�
如图2所示，洗脱组分为2个，将SFPS-B1、SFPS-B2流水透析至无Cl-后冷冻干燥。取洗脱部分SFPS-B1，本研究对SFPS-B1进行AFM观察。�
图2 SFPS-B Sephadex G200凝胶色谱纯化
2.3 羊栖菜多糖SPFS-B1的原子力显微镜（AFM）图�
图3、图4是SFPS-B1在云母片上的AFM图像，扫描范围分别为44μm×44μm，扫描频率1.02Hz，从图中可以看出多糖分子链出现近似棒状螺旋结构，糖链的密度依赖于其初始浓度及其沉积到云母片表面的量；图像的对比度依赖于针尖上的作用力，作用力太大易损坏糖链，而太小则对比度差，很难得到清晰、稳定的图像，最佳的作用力大概在3~4nN量级以内。�
从图3和图4中可以清楚看到多糖分子链及其侧枝，聚合物链分子间相互缠绕，链间通过糖单元间不同的链接方式衍生出一些棒状或带有分支的侧链结构，具有近似棒状螺旋结构，且排列紧密，聚合物链分子间相互缠绕，单链的厚度为7nm左右，长度20nm~0.5μm范围内，宽度为10nm左右，远大于单链分子的估算值，这是由于有限大小的针尖扫描不同的部位与分子链作用，从而导致增宽效应。通常来说，多糖分子链大小一般为0.1~1.0nm，我们得到的图像显示的盘绕股粗细为10nm左右，说明每股并非围单个糖链便形成多个糖链缠绕成股的情况，提示多糖在结构上呈缠绕和螺旋结构。
图3 SFPS-B1的AFM图扫描范围44μm×44μm
图4 SFPS-B1的AFM图扫描范围44μm×44μm
图5是羊栖菜多糖分子的高分辨图像，从图中可明显观察到单个的分子链及其侧枝结构，以及分子内的缠绕和螺旋状结构，螺圈相互连接成链，这些螺旋结构的左旋和右旋，可能和多糖的L型与D型有关，也可能与单糖之间的连接方式有关，尚需进一步研究证实，羊栖菜多糖链呈多股紧密的螺旋形排列，这种现象可能是由于该多糖中分子间的Van der Waals相互作用以及所含糖醛酸发生糖链间氢键缔合所致。�
图5 放大图
3 讨论�
羊栖菜多糖由于其相对分子质量大、结构复杂、自身常存在结构缺陷，无法得到良好的晶形，对其二级结构以及高级结构的研究比较困难。原子力显微镜（AFM）是近年来发展起来的研究多糖高级结构的一个十分有力的工具。蔡林涛等［7］用AFM扫描观察虫草多糖分子链呈分枝结构。
马秀俐等［8］用AFM观察到西洋参多糖（PPQ-d）的分子链聚集状态呈多股紧密并行螺旋形排列。羊栖菜SFPS-B1分子间相互缠绕，单链的厚度为7nm左右，长度20nm~0.5μm�范围内，宽度为10nm左右，远大于单链分子的估算值，这是由于有限大小的针尖扫描不同的部位与分子链作用，从而导致增宽效应。考虑到该多糖化合物的高糖醛酸含量和分子间的van der Waals相互作用，我们认为一个糖链上的糖醛酸羧基或羧基负离子上的强电负性氧原子与另一糖链上的羟基氢易于形成分子间氢键，依次类推，多个糖链之间通过Van der Waals引力和氢键相互作用缠绕成股，但以上观察尚难以得知分子间氢键的距离，因此无法推算每股螺旋组成糖链的数目。�
多糖的立体构型是决定多糖生物活性的决定因素之一，对多糖寡糖片段和多糖单链的构象以及多糖与缀合物的空间关系的研究具有重要意义。许多科学家认为多糖的高级结构对功能的影响比一级结构重要。但由于多糖结构复杂，目前对于多糖高级结构的研究还较少，至今还没有一种有效的方法。原子力显微镜（AFM）是研究多糖高级结构的一种有效方法，尽管AFM在多糖结构方面的研究报道不多，但用AFM能获得多糖高级结构稳定、清晰的图像，AFM的这些特点已经为多糖结构的深入研究提供了极大的方便。将AFM与其它现代表征手段联用是研究多糖高级结构的发展方向，具有广泛的应用前景。�
参考文献：�
［1］ Astbury，W.T.Nature，1983，141，747.�
［2］ Lin，K.C.；Weis，R.M.；MeConnell，H.M.Nature，1982，296，164.�
［3］ Kirby，A.R.；Gunning，A.P.；Morris，V.J.Biopolymers，1996，38，355.�
［4］ Rief，M.；Oesterhelt，F.；Heymann，B.Science，1997，275，1295.�
［5］ 马孜，吕百达，肖琦，等.光学薄膜表面形貌的原子力显微镜观察［J］.电子显微学报，2000，19（5）：701-708.�
［6］ 陈德亮，李辉，韩宝善，等.高碱性pH诱导紫膜片层表面结构变化的原子力显微镜直接观测［J］.生物化学与生物物理进展，2003，30（5）：711-714.�
［7］ 蔡林涛，李萍，陆祖宏.原子力显微镜观察虫草多糖分子的结构形貌［J］.电子显微学报，1999，18（1）：103-105.�
［8］ 马秀俐，白玉白等西洋参多糖（PPQ-d）的原子力显微镜观察 ［J］.吉林大学自然科学学报，2000，1（1）：105-106.�
（责任编辑：王尚勇）
