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[摘要] 目的 探讨载脂蛋白B、E（ApoB、ApoE）基因及血管紧张素原基因（AGT）多态性与冠心病（CHD）的相关性。方法 采用基因芯片技术分析89例CHD患者和78例非CHD患者的ApoB Xba I、ApoE112/158及AGT M235T基因多态性及等位基因频率。结果 CHD组ApoB Xba I、ApoE112/158及AGT M235T基因型分布与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。CHD组的ApoB Xba I的X+X+基因型及等位基因X+频率显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），ApoE112/158的ε3/4、ε4/4基因型及等位基因ε4频率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CHD组AGT-TT基因型频率及T等位基因频率均明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论ApoB Xba I、ApoE112/158和AGT M235T的基因多态性可能是中国人CHD的危险因素。ApoB Xba I等位基因X+；ApoE112/158的等位基因ε4和AGT M235T基因的T等位基因是CHD的重要遗传标记。
[关键词]冠心病；载脂蛋白B；载脂蛋白E；血管紧张素原；基因；多态性
[中图分类号] R541.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）19-04-03
The Research of Apolipoprtein B，E and Angiotensinogen Gene Polymorophisms in Predisposition to CHD
MA Juan ZHANG Hongqing WANG Wei TIAN Qing
Department of Cardiology，The First People’s Hospital of Kunming City，Kunmimg 650011，China
[Abstract] Objective To explore the relationship of apolipoprotein B，E（ApoB，ApoE）and angiotensinogen（AGT）gene polymorphism with coronary heart disease（CHD）. Methods Gene chip technology was performed to analyze ApoB XbaⅠ、ApoE 112/158 and angiotensinogen gene polymorphism. The allele frequency and gene type distribution were compared between groups. ResultsThere was a significant difference in the distributuion of Apo B，ApoE and AGT gene type between patients and controls（P＜0.05）. The frequency of X+X+ genetype and X+ allele of ApoB were significantly higher in patients with CHD than controls（P＜0.05）；the frequency ofε3/4、ε4/4 genetype andε4 allele of ApoE112/158 were higher in patients with CHD than controls（P＜0.05）. AGT-TT gene type was related with CHD significantly（P＝0.003）and T allele was more frequent significantly in CHD group than controlls（P＜0.05）. ConclusionThe Apo B，ApoE and AGT gene polymorphism may be the risk factors of CHD；X+ allele of ApoB Xba Ⅰ andε4 allele of ApoE gene and T allele of AGT gene might be the geneticmarkers of CHD.
[Key words] Coronary heart disease；Apolipoprotein B；Apolipoprotein E；Angiotensinogen；Gene；Polymorphism
冠心病（CHD）是严重危害人类健康的常见心血管疾病，病因是由遗传因素和环境条件共同决定的，在CHD的发生和发展中，遗传因素可能更为重要。近年来已相继研究发现了一些与之相关致病或易感基因，其中包括血管紧张素原（AGT）、亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因、一氧化氮合酶（NOS）基因以及脂质代谢相关基因位点等，这些基因结构和（或）表达异常可导致CHD，但各地报道不一，未见基因芯片联合分析ApoB、ApoE及AGT基因多态性与CHD相关性的报道，本研究应用基因芯片技术联合检测多个基因多态性及等位基因频率，分析它们与CHD的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2005～2006年昆明市第一人民医院心内科收住的CHD患者89例，符合缺血性心脏病（IHD）的命名和诊断标准，均为冠状动脉造影证实冠状动脉病变患者；其中男62例，女27例，平均年龄（60.01±12.40）岁。同期78名非CHD患者作为对照组，均行冠状动脉造影术无冠脉病变；其中男44例，女34例，平均年龄（64.27±11.28）岁。两组患者一般资料（平均总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、心脏超声心动图测平均左室舒张末径、平均左室收缩末径、左室射血分数）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.2方法
采用基因芯片检测技术，结合PCR体外扩增方法，检测人类冠心病相关基因ApoB Xba I、ApoE112/158、AGT M235T的多态性情况。
1.2.1标本采集 用一次性无菌注射针头采集被检者静脉血0.5mL，收集于含50μL的2%EDTA溶液的1.5mL的无菌离心管中，盖上管盖，上下颠倒数次使混匀。
1.2.2 存放 上述血样在2～8°C保存，保存期不应超过3周；在-20°C保存期半年，-80°C可长期保存，但严禁反复冻融。
1.2.3扩增 采用适用0.2mL扩增管并有热盖的PCR扩增仪。
1.2.4 杂交 在芯片杂交过程中采用温控精度为±0.5°C的恒温设备（BaiO FLWS-526全自动杂交仪）进行杂交。
1.2.5 识读 在芯片杂交信号检测时采用BaiO BE-2.0生物芯片识读仪识读。图像Array Docctor软件分析可自动输出检测结果，最后检测出ApoB Xba I、ApoE112/158及AGT M235T基因的多态性位点。
1.3 质量控制
在每次检测中都应设置阴性、阳性、对照品。产品检测过程中，若软件对“标志列、阴性、阳性对照”三者进行判断后，输出其中之一为“不合格”，则实验无效。
1.4 结果判断
由软件自动判断并输出结果。当软件判断标志列、阴性、阳性对照均合格时，会自动输出检测结果。见表1。
1.5 统计学处理
采用SPSS11.0软件包作统计学处理。ApoB Xba I、ApoE112/158及AGT M235T基因型和等位基因频率之间的比较用χ2检验，同时计算优势比（OR）及95%可信区间（95%CI）。
2结果
2.1 AGT M235T基因型及等位基因频率的分布情况
CHD组以AGT-TT基因型最常见，对照组AGT-MT基因型最常见；CHD组AGT M235T基因型分布与对照组相比有明显差异（P＜0.05），易感等位基因T频率高于对照组（P=0.01，CI=0.339～0.864；OR=0.541），显示AGT基因多态性与CHD发病存在关联。见表2。
2.2 ApoB Xba I基因型及等位基因频率分布
CHD组及对照组ApoB Xba Ⅰ基因型均以X+X+型最常见，CHD组X+X+基因型明显高于对照组，两组基因型分布相比均有显著差异（P＜0.05），CHD组等位基因X+频率明显高于对照组（P＜0.05，OR=3.46，CI=1.554～7.681）。显示ApoB基因多态性与CHD发病存在密切关联，等位基因X+与CHD发病正相关。见表3。
注：与对照组比较，*P＜0.05
2.3CHD组ApoE112/158 基因型及等位基因频率分布等位基因频率情况
CHD组ApoE112/158等位基因频率：ε3＞ε4＞ε2；对照组ε3＞ε2＞ε4；CHD组以ε3/3型最常见，ε3/4型次之；对照组以ε3/3型最常见，ε2/3型次之两组基因型分布相比均有显著差异（P＜0.05）；冠心病组ε3/4、ε4/4基因型频率明显高于对照组（P＜0.05），ε4等位基因频率明显高于对照组（P＜0.05，OR=2.301，CI=1.203～4.398），两组的ε3等位频率没有明显差异，显示ApoE基因多态性与CHD发病存在密切关联，ε4等位基因与CHD发病正相关。见表4。
2.4 AGT-TT, ApoE-ε4/4,ApoB- X+X+联合基因型分布情况
在CHD组未发现AGT-TT、ApoE-ε4/4、ApoB-X+X+基因型联合出现。
3 讨论
近年来由于研究手段的进步，人们对CHD的遗传背景给予了更多的关注，其中AGT M235T多态性与冠心病的关系倍受重视。AGT-TT基因型可能通过协同效应增加促血管紧张素Ⅱ的生成而增加了CHD的发病危险。1995年Katsuya等[1]进行AGT M235T多态性的调查，发现AGT基因的T/T型频率在CHD组为21.9%，显著高于对照组的14.5%，AGT T/T型是CHD的独立危险因素。梁茜等[2]研究发现AGT的基因多态性可能是中国老年人CHD的独立危险因素。本研究也观测到CHD组AGT M235T基因型分布与对照组相比有显著差异，AGT-TT型及T等位基因频率均明显高于对照组，提示AGT M 235T多态性与CHD发病有关。
脂质代谢紊乱是致动脉粥样硬化（AS）及CHD发生的最重要的危险因素。目前发现ApoB基因cDNA第7673位核苷酸C-T突变，产生了一个XbaⅠ切点，即X+等位基因，它与脂质代谢紊乱密切相关。Guzman等[3]研究发现在高血脂女性患者中ApoB XbaⅠ基因多态性与总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDLC）水平增高显著相关。李莎等[4]研究发现具有冠心病家族背景的X+等位基因的个体显著高于对照，而且相应的TC、LDLC和ApoB100水平也明显高于对照组，它们是汉族人群中冠心病发病的重要遗传标记。资料表明[5]（浙南地区）正常人组Apo B基因的多态Xba Ⅰ酶切位点以X-占优势，而CHD组XbaⅠ酶切位点以X+频率为优势，和正常人组对比差别显著。本研究结果示CHD组ApoB XbaⅠ基因型分布与对照组相比有明显差异，CHD组X+X+基因型及等位基因X+频率明显高于对照组，与国内报道一致，提示ApoB XbaⅠ的基因多态性是CHD遗传危险因素，等位基因X+是CHD的重要遗传标记。
ApoE基因多态性是决定血脂水平进而影响动脉粥样硬化病变发生发展的遗传因素之一。不同的ApoE表型对CHD的易感性不同，研究表明有ε4等位基因CHD的发生频率最高，而ε2等位基因可能由于有两个游离的巯基，因此ε2者较少患CHD、颈动脉疾病或中风，对心血管具有保护作用。Kolovougd等[6]通过大批量标本研究发现基因多态性并没有性别的差异性。Banaresvg等[7]发现ApoEε4等位基因和冠心病有着很大的关联，并且呈现年龄依赖性，是一个非常重要的遗传因素。本文CHD组ε3/4、ε4/4基因型和ε4等位基因频率明显高于对照组，ε2等位基因频率明显低于对照组，显示ε4等位基因与CHD发病存在密切关联。两组的ε3等位频率没有明显差异。本研究结果和国内外相关报道一致，支持ApoE等位基因多态性与冠心病之间存在关联，提示ε4等位基因是动脉硬化发生的潜在因素，为冠心病的易患因子，而ε2等位基因对冠状动脉粥样硬化的发展可能有保护作用。
本研究应用基因芯片技术，将中国人的AGT、ApoB、ApoE基因型探针固定于同一张基因芯片表面，利用碱基互补配对原理进行杂交，通过检测探针分子杂交信号强度，在同组人群同时检测多种CHD易感基因的多态性位点，其特点是高效、快速、自动微型化、高通量、高度并行性及高度敏感性，有着广泛的应用前景。对于多基因病包括，使用基因芯片技术进行基因多态性联合分析比单一基因更有价值，将来可根据不同基因型进行个体化预防、治疗和病情随访。
[参考文献]
[1] Katsuya T，Koike G，Yee TW，et al. Association of angiotensinogen gene T235 variant with increased risk of coronary heart disease[J]. Lancet， 1995，345（8965）：1600-1603.
[2] 梁茜，董吁钢，杨希立，等. 基因芯片技术分析老年冠心病患者的易感基因[J]. 中华老年医学杂志，2006，25（6）：420-423.
[3] Guzman EC，Hirata MH，Quintao EC，et al. Association of the apolipoprotein B gene polymorphisms with cholesterol levels and response to fluvastatin in Brazilian individual with high risk for coronary heart disease[J]. Clin Chem Lab Med，2000，38（8）：731-736.
[4] 李莎，雷兆文，陈子立，等.冠心病家族史青少年载脂蛋白E、B的基因多态性[J].中华医学遗传学杂志，2003，20（3）：241-243.
[5] 谭应霞，俞康，沈志坚，等. 浙南地区人群ApoB、ApoE等位基因频率的初步研究[J].癌变、畸变、突变杂志，1998，11（2）：78-80.
[6] Kolovou GD，Anagnostopoulou KK，Mikhailidis DP，et al. Apolipoprotein E genotype in matched men and women with coronary heart disease[J]. Ann Clin Lab Sci，2005，35（4）：391-396.
[7] Banares VG，Peterson G，Aguilar D，et al. Association between the APOε4 allele and atherosclerosis is age dependent among Argentine[J]. Hum Biol， 2005，77（2）：247-256.
（收稿日期：2011-03-08）
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