【www.zhangdahai.com--专题心得体会】
[摘要]目的 探讨我国浙江汉族人群Toll样受体4（TLR4）基因（Asp299Gly和Thr39911e）多态性与创伤后脓毒血症的关系。方法 在50例创伤后脓毒血症患者和100例正常对照者中，采用等位基因特异性聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法（ASPCR-RLFP）检测TLR4 Asp299Gly和Thr39911e基因多态性，分析TLR4基因多态性与创伤后脓毒血症的相关性。结果 在所有的研究对象中均未发现TLR4 Asp299Gly和Thr39911e基因突变。结论 浙江汉族人群TLR4 Asp299Gly和Thr39911e基因多态性与创伤后脓毒血症易感性可能无相关性。
[关键词] TLR4；创伤性脓毒血症；基因多态性
[中图分类号] R631 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）31-25-02
Correlation between the Genetic Polymorphism of Toll-like Receptor 4 and Traumatosepsis
SUN Laifang WANG Zhiyi JIANG Yi GONG Yuqiang KONG Wanquan CHEN Daqing
Department of Emergency， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325027， China
[Abstract] Objective To investigate the relationship between Toll-like receptor-4（TLR4） gene（Asp299Gly and Thr399 Ile） polymorphism and traumatosepsis among Chinese Han nationality from Zhejiang Province. Methods Fifty patients with traumatosepsis and 100 healthy controls were recruited. TLR4 gene Asp299Gly and Thr399Ile polymorphism were analyzed by allele-specific polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（ASPCR-RFLP）.The association between the gene polymorphism and traumatosepsis was analyzed. Results The mutant genotypes of TLR4 gene Asp299Gly and Thr399Ile were not found in all subjects. Conclusion The TLR4 gene Asp299Gly and Thr399Ile polymorphism may not associated with susceptibility to traumatosepsis in Chinese Han population from Zhejiang Province.
[Key words] Toll-like receptor（TLR4）； Traumatosepsis；Genetic polymorphism
脓毒血症（Sepsis）是指感染和创伤等引起微生物侵入人体诱发剧烈的全身炎症反应，并引起组织器官继发性损伤的病理生理过程及临床症候群，主要由革兰氏阴性杆菌感染所致。创伤后脓毒血症的诊治一直是临床急救医学的热点和难点，临床研究发现创伤后脓毒血症的发生、严重程度及预后存在明显个体差异。本研究从遗传免疫学的角度出发，在浙江汉族人群中探讨创伤后脓毒血症的易感性和TLR4基因Asp299Gly和Thr39911e多态性的关系，为阐明创伤后脓毒血症的先天性免疫机制提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
研究样本来源于2007年1月～2009年1月收住我院的创伤后脓毒血症患者及同期来院健康体检者，所有研究对象均已签署实验知情同意书。创伤后脓毒血症病例组50例，男36例，女14例，年龄26～70岁，平均年龄（51±16.5）岁；正常对照为100例健康体检者，其中男60例，女40例，平均年龄（52±9.4）岁。以上研究对象均为无血缘关系的浙江汉族人。两组间性别和年龄分布无显著性差异（P=0.56）。
1.2 盐析法提取基因组DNA[1]
所有研究对象各取空腹静脉血5mL，EDTA抗凝后备用。取血样0.5mL加细胞裂解液一（内含10mmol/L Tris~HCl pH8.0，10mmol/L KCl，10mmo1/L MgC12，2mmol/L EDTA pH8.0和2.5%Triton x~100）1mL，离心5min（4000r/min），弃上清，再加细胞裂解液一，重复上述步骤两次。加细胞裂解液二（内含10mmol/L Tris~HCl，pH8.0，10mmol/L KCl，10mmol/L MgCL2，2mmol/L EDTA pH8.0，0.4mmol/L NaCl和10g/L SDS）0.2mL，置56℃ 水浴孵育15min，加入饱和NaCl溶液0.1mL混匀，可见蛋白沉淀析出，离心（5000r/min）10min，取上清液，加入2倍体积无水乙醇，离心（12000r/min）5min，沉淀物加0.1mL TE缓冲液（10mmol/L Tris~HCl pH8.0，1mmol/L EDTA），室温下溶解2h后进行DNA定量测定。
1.3 TLR4 Asp299Gly和Thr39911e基因多态性分析
1.3.1 设计引物[2] Asp299Gly位点上游引物：上游引物5’- GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3’，下游引物5’- GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3’，Thr399Ile 上游引物5’- GGTTGCTGTTCTCAAAGTGATTTTGGGA GAA-3’，下游引物5’- ACCTGAAGACTGGAGAGTGAGTTAAATGCT-3’。PCR反应体系总体积25μL，内含引物10pmol，dNTPs 5pmol，TaqDNA聚合酶3U， DNA模板1 μL（约300 ng）。反应条件：94℃预变性3min，接着30个循环（94℃变性30 s，55℃复性30s，72℃延伸30s），72℃终末循环5min，最后置于4℃终止反应。
1.3.2 基因型的判读 Asp299Gly及Thr399 Ile基因PCR扩增产物分别用限制性内切酶Nco Ⅰ、Hinf Ⅰ进行消化酶切，酶切产物采用3%琼脂糖凝胶电泳，并在VILBER LDURMAT 凝胶成像分析系统观察拍照。TLR4 Asp299Gly 与Thr399 Ile基因的PCR 产物长度分别是249bp与406bp ，两者野生型均只有一条带（分别为249bp与406bp），TLR4 Asp299Gly突变体可与错配引物形成一个Nco Ⅰ酶切位点，酶消化后则有226bp 和23bp 两条带。TLR4 Thr399 Ile突变体可与错配引物形成一个Hinf Ⅰ酶切位点，酶消化后则有377 bp 和29 bp 两条带。
2 结果
对50例创伤后脓毒血症患者和100例正常人DNA样本基因多态性分析，发现所有DNA 样本Asp299Gly基因249 bp的 PCR 产物均不能被限制性内切酶Nco Ⅰ酶切为226bp 和23bp两个片段，即所有研究对象Asp299Gly基因均为野生型A，未见突变型G，结果见图1。同样样本中Thr39911e基因406bp 的PCR产物均不能被Hinf Ⅰ酶切为377bp和29bp两个片段，即Thr39911e等位基因也均为野生型，未检测到突变型，结果见图2。
3 讨论
研究证实，Toll样受体4（Toll-like receptor，TLR4）是识别细菌LPS的受体[3-5]，在宿主防御革兰氏阴性菌感染及机体天然免疫中的发挥重要功能。近年来国内外学者非常重视TLR4与各种感染性疾病相关性的研究，有些研究结果显示，TLR4基因Asp299Gly和Thr39911e多态性与革兰氏阴性菌所致的脓毒症的易感性有关。Agnese等[6]研究表明Asp299Gly、Thr399Ile突变可是使革兰氏阴性菌感染发生率明显升高。Barber RC 等[7]研究发现，烧伤患者TLR4的Asp299Gly突变可增加其发生严重脓毒症的危险性。上述研究表明TLR4基因多态性与脓毒症的发生、发展有密切关系，但也有部分研究却未得到相同结果[8-10]。
本研究通过对中国浙江汉族人群TLR4基因Asp299Gly和Thr39911e多态性进行检测，在所有150例样本中均未发现其Asp299Gly和Thr39911e基因有突变，提示此等位基因突变在中国浙江汉族人群中少见，TLR4基因Asp299Gly和Thr39911e多态性与创伤后脓毒血症无显著相关性，说明TLR4基因可能不是脓毒血症的易感基因，这与日本[11]和国内多数学者[12-13]报道一致。与西方白种人相比，包括我国汉族人群在内的东方黄种人TLR4基因多态性Asp299Gly和Thr39911e携带者的比例较低，而在欧美人种Asp299 Gly突变型较常见，芬兰人中其频率高达9.5%[14]。等位基因的多态性随人种和地区的不同而变化，将有助于阐明不同种族和地区人群在创伤后脓毒血症发病机制上的差异。
TLR4在宿主天然免疫应答中发挥重要作用，TLR4基因Asp299Gly和Thr39911e多态性在创伤后脓毒血症的发病机制中不一定发挥着首要作用，本研究发现TLR4基因两个功能性位点与创伤后脓毒血症无明显相关性，可能因其研究对象样本量较小，或者与人种的遗传差别和环境相互作用有关。
[参考文献]
[1] 周新文，石云，周宜开. 盐析法从全血中快速提取高质量的基因组DNA[J].中国医学检验杂志，2000， 1（2）：94.
[2] Lorenz E， Frees KL， Schwartz DA. Determination of the TLR4 genotype using allele-specific PCR[J]. Biotechniques，2001，31（1）：22-24.
[3] Peltier DC，Simms A，Farmer JR，et al. Human neuronal cells possess functional cytoplasmic and TLR-mediated innate immune pathways influenced by phosphatidylinositol-3 kinase signaling[J]. Immunol， 2010，184（12）：7010-7021.
[4] Kirschning CJ，Bauer S. Toll like receptors：cellular signal transducers for exogenous molecular patterns causing immune reponse[J]. Int J Med Microbiol，2001，291（4）：251-260.
[5] Naert G，Laflamme N，Rivest S. Toll-like receptor 2-independent and MyD88-dependent gene expression in the mouse brain[J]. J Innate Immun，2009，1（5）：480-493.
[6] Agnese DM，Calvano JE，Hahm SJ，et al. Human toll-like receptor 4 mutations but not CDl4 polymorphisms am associated with an increased risk of gram-negative infections [J]. J Infect Dis，2002，186（10）：1522-1525.
[7] Barber RC，Chang LY，Arnoldo BD，et al. Innate immunity SNPs are associated with risk for severe sepsis after bum injury[J]. Clin Med Res， 2006，4（4）：250-255.
[8] Skinner NA，MacIsaac CM，Hamilton JA，et al. Regulation of Toll-like receptor （TLR）2 and TLR4 on CD14dimCD16+ monocytes in response to sepsis-related antigens[J]. Clin Exp Immunol，2005，141（2）：270-278.
[9] Gioannini TL，Teghanemt A，Zhang D，et al. Monomeric endotoxin：protein complexes are essential for TLR4-dependent cell activation[J]. J Endotoxin Res，2005，11（2）：117-123.
[10] Lorne E，Dupont H，Abraham E. Toll-like receptors 2 and 4：initiators of non-septic inflammation in critical care medicine? [J]. Intensive Care Med，2010，36（11）：1826-1835.
[11] Imamura Y，Fujigaki Y，Oomori Y，et al. Polymorphism of genes encoding toll-like receptors and inflammatory cytokines in periodontal disease in the Japanese population[J]. J Int Acad Periodontol，2008，10（3）：95-102.
[12] 冯凯，周钢桥，翟芸，等. TLR4基因多态性在中国人群中的初步研究[J]. 中华医学遗传学杂志，2005， 22（1）：99-101.
[13] 郭秋莎，夏冰，李瑾. TLR4 基因Asp299Gly 多态性与中国汉族炎症性肠病及大肠癌患者无关[J]. 中华消化杂志，2004，24（5）：306-307.
[14] Lorenz E，Hallman M，Marttila R，et al. Association between the Asp299Gly polymorphisms in the Toll like receptor 4 and premature births in the Finnish population[J]. Pediatr Res，2002，52（3）：373-376.
（收稿日期：2011-08-01）
