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【摘要】 目的 研究十味接骨药对家兔骨折骨细胞生长修复过程中骨痂中TGF-β�1,羟脯氨酸、钙、磷;血清中碱性磷酸酶、钙、磷的变化和作用机理。方法 实验用健康日本大白兔81只5~6月龄造成双侧前肢0.7 cm横断性骨缺损,保留尺骨完整,并分成三组,对照组和实验组,空白组不用药,实验组给十味接骨药,对照组给骨折挫伤散。2周、5周、8周分别取材,观察十味接骨药对骨折修复的影响。结果 实验组骨痂中TGF-β�1、HRP先升高后递减;血中骨痂中Ca、P峰值提前出现,血中ALP随骨生长逐渐升高。与对照组相比较统计学�*P 1.6 观察指标与方法
1.6.1 血样分析 三组动物按三个时间段进行P-ALP、S-Ca、S-P分析,将兔放兔盒中固定,选耳后静脉清晰部位拔除局部绒毛,75%乙醇消毒,摩擦静脉使之扩张,用6号针头在耳缘静脉末稍刺破血管,待血渗出后用注射器抽取血液2 ml放不加抗凝剂试管中,用80-Z离心机离心制成血清,用奥林巴斯AU-2700全自动生化分析仪分析血清钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)。
1.6.2 骨痂分析 羟脯氨酸(HRP)、钙(Ca)、磷(P)。将新鲜骨痂用丙酮脱脂脱水12 h真空干燥称重,用10%三氯乙酸脱钙脱磷,用甲基百香酚蓝比色法测提取液中的钙;用孔雀绿直接显色法测提取液中的磷,剩余骨痂用蒸馏水冲洗,滤纸吸去多余的水分称重,用样本碱水解法测骨痂中的羟脯氨酸。具体做法:①骨痂标本丙酮脱脂脱水,用TH2-88-1型多用恒温台式振荡器振荡3 h后,静置12 h,使脱水完全取出样本置于真空干燥皿中,用SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵真空干燥后,用MettierH54AR十万分之一分析电子天平称重,将干燥样本浸在3 ml,10%三氯乙酸中提取样本中的钙、磷24 h取出样本待用。按试剂盒说明方法测钙、磷;②用甲基百香酚蓝比色法测提取液中的钙(Ca)含量,空白管、标准管,测定管中各加1.0 ml甲基百香酚蓝(MTB)试剂和2.0 ml碱性溶液,空白管加20 μl去离子水,标准管加20 μ、25 mmol/L钙标准液测定管中加20 μl待测提取液,分别混匀静置5 min后,波长610 nm、1 cm光径,蒸馏水调零,HP8452A紫外可见分光光度计测各管吸光度;③用孔雀绿直接显色法测提取液中磷含量,空白管标准管测定管分别加入1 ml尿素溶液2 ml孔雀绿-钼酸液,再空白管中加20 μl去离子水,标准管加20 μl、1.29 mmol/L磷标准应用液,测定管加20 μl待测提取液,分别混匀,室温准确放15 min,640 nm、1 cm光径,蒸馏水调零用HP8452A紫外可见分光光度计测各管吸光度;④从10%三氯乙酸中取出骨痂样本经蒸馏水冲洗后滤纸吸取多余水份,用电子天平称重(取样本湿重)用样本水解法测羟脯氨酸(HRP)含量。精确称取样本湿重(30～100 mg)后放入试管中,准确加入水解液1 ml混匀加盖后放入沸水浴水解20 min(10 min时混匀一次使水解更充分),然后取出,将各试管流水冷却后,各管加指示剂1滴摇匀。各试管准确加入调PH甲液1.0 ml混匀(此时溶液为红色)用200 μl加样器吸取调PH的乙液向各管逐滴小心加入调PH的乙液,每滴加入后摇匀,直至液中试剂颜色变成黄绿色,此时PH值6.0~6.8左右。再加蒸馏水至10 ml混匀,取3~4 ml稀释的水解液加适量活性炭(约20~30 mg),以上清液离心澄清无色为准。3500转/ min离心机离心10 min,经滤纸滤后,取清液1 ml做检测。空白管、标准管、测定管分别加1.0 ml蒸馏水1.0 ml 5 μg/ ml标准应用液1.0 ml待测定,然后各加0.5 ml试剂混匀,静置10 min,加试剂二0.5 ml混匀,60℃水溶15 min,冷却后,3500转/min,离心机离心10 min,取上清液550 nm波长1 cm光径,蒸馏水调零,测各管吸光度读数。
1.6.3 免疫组化实验微波脱钙。用7.15EDTA液适量,方法:将骨组织放入微波专用盒,根据组织的多少放适量的脱钙液在微波下55℃间歇脱钙,以每次辐射2 min为一脱钙循环,经过反复筛选以30个脱钙循环为最佳脱钙终点,在2个循环之间将标本盒出微波炉外,室温冷却5 min,保证每次辐射中脱钙温度,随时更换新液,5 d后骨组织脱钙完毕,以针灸针能穿透骨组织为脱钙终点。脱钙后福尔马林溶液常规固定24 h,常规梯度乙醇脱水75%~100%乙醇,各脱水6 h。二甲苯透明1 h,60℃ 恒温箱浸腊分别1 h、0.5 h。石腊包埋,作3 μm切片裱片,脱腊至水,一部份做HE染色,一部份做S2P(链霉素菌抗生蛋白过氧化物酶)染色。(4)S2P染色检测:30%过氧化氢孵育15 min,清除内源性过氧化物酶的活性;蒸馏水冲洗0101 molpL PBS浸泡5 min×3次;微波炉修复抗原10 min;0101 molpl PBS浸泡5 min×3次;抗原修复室温10 min;倾去修复液,滴加30 μl按一定倍数稀释的一抗(1:200),40℃过液;0101 mo1PL PBS浸泡5 min×3次;滴加生物素标记的二抗(1:150)30 μl,37℃孵育30 min;0101 molpL PBS浸泡5 min×3次;辣根酶标记的链酶卵白素(1:150)30?l;37℃孵育30 min;0101 molpL,PBS浸泡5 min;DAB显色5 min,自来水充分水洗,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,DPX封片。(5)HE染色检测:常规二甲苯脱蜡至水(二甲苯脱腊5 min×1次,二甲苯脱腊5 min×2次;二甲苯脱蜡5 min×3次,100%乙醇脱苯5 min×2次;95%乙醇脱苯5 min×2次,90%乙醇脱苯5 min×1次,85%乙醇脱苯数秒,自来水冲洗数秒)。苏木素细胞核染色10 min自来水冲洗数秒,10%盐酸乙醇分化数秒,背景无色温水蓝化10 min;伊红30 s胞浆染色。梯度乙醇脱水(80%乙醇数秒,85%乙醇数秒,90%乙醇数秒,95%乙醇5 min×2次,100%乙醇5 min×2次)。二甲苯透明5 min×3次,二甲苯透明5 min×2次。中性树胶封片。
1.7 统计学方法
采用SPSS 12.0统计软件包,计量以x±s表示,二组间比较用t检验,多组比较用方差分析。
2 结果
2.1 血液化学分析(x±s)三组动物的碱性磷酸酶、钙、磷有明显差异。实验组动物碱性磷酸酶、钙、磷变化明显高于对照组和空白组,随着骨折修复的逐渐完成其改变随之增高。5周时达到高峰,碱性磷酸酶显著升高,钙磷乘积峰值升高。说明十味接骨药能提高动物成骨细胞的成骨活性和促骨基质合成作用。能促钙盐沉积过程超前出现,对骨化骨塑形,促骨愈合起到重要作用。对照组、空白组、实验组动物有相似钙、磷、碱性磷酸酶含量先递增,随着骨修复又递减规律,实验组与对照组统计学差异显著,看出十味接骨药有促进骨修复区内骨痂生长和钙化的作用。(见表1)。
表1
血液生化分析结果(x±s,mmol/L)
时间N
二周五周八周
s-Cas-Pp-ALPs-Cas-Pp-ALPs-Cas-Pp-ALP
对照组62.88±0.971.17±0.2365.33±21.593.145±0.441.53±0.5282±21.423.06±0.431.62±0.5657.83±1.83
空白组61.93±0.211.01±0.0136.5±5.361.95±0.211.11±0.1067.2±11.032.54±0.121.02±0.0238.33±3.98
实验组153.56±0.501.46±0.2891.47±27.913.47±0.192.42±0.62110.8±28.383.43±0.132.28±0.3877.60±17.04
注:与对照组比较�*P 十味接骨药,能刺激TGF-β�1活跃,能诱导骨折愈合,它的分泌旺盛给骨折愈合奠定了先决条件和物质基础。骨和血小板中TGF-β�1的含量最为丰富,在骨折修复过程中,一方面血小板通过脱颗粒作用向骨折处释放高浓度TGF-β�1,刺激相邻的骨细胞增生和增加基因蛋白的合成。另一方面骨折局部的修复细胞自身合成并分泌TGF-β�1,并刺激这些细胞功能活跃,这样以自身分泌和旁分泌的方式调节骨折愈合不同阶段的细胞功能,从而促进骨折愈合[5]。在骨折愈合早期,便有骨端骨膜反应,由骨膜生发层细胞分化,增殖而形成成熟的骨细胞,TGF-β�1在此时其对骨膜生发层细胞及成熟的骨细胞均有表达,说明其对骨膜生发层细胞定向分化为成骨细胞,以及成骨细胞的成熟起重要作用。TGF-β�1 是激发骨折修复的重要诱导因子,TGF-β�1的表达随骨细胞的成熟肥大而衰减的同时,此时又在成骨细胞内旺盛分泌刺激着骨基质的形成、沉积,直至骨性愈合[6]。实验中,实验组与对照组修复中 TGF-β�1的表达,实验组始终比对照组提前3周,说明十味接骨药疗效确切。
羟脯氨酸,在骨痂生长中的升高,是促进骨断端胶原蛋白尽早形成不可缺少的重要物质,对加速骨修复很重要。当骨痂中羟脯氨酸含量增加,可加速骨折愈合,能激活骨修复细胞的活性,促进了对胶原的合成分泌,使骨的断端胶原增加,对骨折愈合提供了良好的基础。
实验中HRP,随骨修复逐渐升高规律,实验组高于对照组,说明十味接骨药能使动物骨折修复中HRP增加,使骨胶原蛋白合成分泌增加,促骨愈合加快的作用。实验中看出十味接骨药能提高成骨细胞的活性,促进胶原蛋白合成促进骨痂区钙化进程加快,从而对骨修复有明显作用的机理。
参 考 文 献
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