【www.zhangdahai.com--演说演讲稿】
摘要： 目的：建立高效液相色谱法测定白花蛇舌草中槲皮素和山奈素含量的方法。方法：采 用伊利特-C18柱（4.6mm×250mm 5μm），流动相为乙腈-甲醇-0．2％磷酸(体积 比10∶45∶60)，流速为1 ml/min，检测波长为370 nm。结果：槲皮素在4.20~25.20 μg（r=0.9999），山奈素在0.97~11.64 μg（r=0.9997） 的范围内与峰面积呈良 好线性关系。平均加样回收率分别为100.48%，97.85%，RSD分别为1.01%(n=3)，1.36% （n＝3）。结论：本法快速、简便、准确，可用于分别测定白花蛇舌草中槲皮素和山 奈素的含量，为评价白花蛇舌草的内在质量提供科学依据。
关键词：白花蛇舌草；槲皮素；山奈素；高效液相色谱法
中图分类号： R927.2 文献标识码： A 文章编号： 1008-2409(2008)05-0899-02
Content determination of quercetin and kaempferol in Hedotis diffusa Willd by HP LC/CHEN Wei，LUO YU-lan，YANG Han-yan∥Dept.of Pharmacy,The Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 5 41001, China
Abstract: Objective：To determine the content of quercetin and kaempferol in He dyotis difusa Willd．Methods：The analysis was performed on an HPLC C18 column( 4．6 mm×250 mm，5um)at the detection wavelength of 370 nm．The mobile phase co nsisted of second nitriles-methanol-0．2％ phosphoric acid(10:45:60) with a fl ow rate of 1 mL/min．Results： The calibration curve was linear in the range of4.20~25.20ug (r=0．9999) of quercetin．And in the range of 0.97~11.64ug（ r=0.999 7） of kaempferol. The average recovery was 100.48%with RSD 1.01%(n=3) ofquerc etin and 97.85% with RSD 1.36%(n=3) of kaempferol．Conclusion： The method i s si mple， rapid and accurate for the determination of quercetin and kaempferol in H e dyotis diffusa Willd, which could be used for the quality control of Hedyotis di fusa Willd．� Key words:Hedyotis diffusa Willd；quercetin；kaempferol；HPLC
白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd．)的干燥全草，研究表明该 植物主要含有黄酮类、三萜类、蒽醌类、环烯醚苷萜类、甾醇类、烷烃类等成分，具有抗肝 炎、抗肿瘤、抗病毒、抗炎抑菌、降血脂及降血糖等多种药理活性［1］。虽然白花 蛇舌草 黄酮类化合物中槲皮素高效液相色谱法的含量测定有文献报道［2］，但同时对白 花蛇舌 草中槲皮素和山奈素进行含量测定分析未见报道。笔者采用高效液相色谱法测定白花蛇舌 草中槲皮素和山奈素的含量，为评价白花蛇舌草的内在质量提供科学依据。
1 材料
高效液相色谱仪：美国Agilent HP1100系列高效液相色谱仪（包括Agilent G1310A单元泵、 Agilent G1316A柱温箱、Agilent G1314A可变波长检测器）；威马龙工作站；TDX高速离心 机（美国Abbott公司）。旋涡混合器；电子精密天平(Ohaus)；KS．1500超声清洗器(宁波科 胜仪器厂)。
白花蛇舌草(市售，批号2007001，2007002，2007003)：经本校药植教研室陈再兴老师鉴定 均为白花蛇舌草；槲皮素、山奈素对照品(中国药品生物制品 检定所，批号100081~200406，110861~200304供含量测定用)；乙腈、甲醇为色谱纯；磷酸 为分析纯；水为二次纯化水，其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：伊利特-C18柱（4.6mm×250mm ，5 μm）；流动相：乙腈-甲醇-0．2％ 磷酸(体积比1 0：45：60)；检测波长：370 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：35℃；进样量：20μl。 在此色谱条件下，按“2.2～2.4”项下对照品、供试品、阴性对照进行分析，结果槲皮素和 山奈素的分离度大于1.5，阴性对照无干扰，色谱详见图1。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取经五氧化二磷干燥12h的槲皮素、山奈素对照品适量，加甲醇制成含槲 皮素1.05mg/ml、山奈素0.2425mg/ml的混合对照品贮备液，备用。取混合对照品 贮备液0.08ml于图1 高效液相色谱图
A.对照品；Ｂ.供试品；C.阴性对照品；1.槲皮素；2.山奈素
10ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取白花蛇舌草药材粗粉1.0 g，精密称定，放入250ml圆底烧瓶中，精密量取50％ (体积分数)甲醇20ml和盐酸1ml置于圆底烧瓶中，密塞，并称定其重量，在水浴上加热回流2h，放冷却后，量取50％(体积分数)甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液 5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液用微孔滤膜(0．45μm)滤过，取 续滤液，即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
以甲醇为阴性对照溶液。
2.5 线性关系的考察
精密吸取“2.2”项下储备液0.04，0.08，0.10，0.12，0.16，0.20，0.24ml于10ml容量瓶 中 ，甲醇稀释至刻度，摇匀。取20μl进样，以峰面积（A）对进样量（C）进行回归分析，得 回 归方程为回归方程A��槲皮素=62712C+377.04，（r=0.9999）；A��山奈素=6 74 43C+3071.7，（r=0.9996）。结果，槲皮素在4.2~25.2μg，山奈素在0.97~11.64μg呈 良好的线性关系。
2.6 精密度试验
精密吸取同一对照品溶液20 μl，在上述色谱条件下平行测定5次，记录槲皮素和山奈素的 峰面积，结果RSD分别为0.86%和0.92%(n=5)，表明精密度较好。
2.7 稳定性试验
取同一供试品溶液在放置0，2，4，8，12，24h后，按上述色谱条件，分别进样20 μl，记 录 槲皮素和山奈素的峰面积， 结果RSD分别为0.89%（n=6）和0.60%(n=6)，表明本法 稳定性较好。
2.8 重复性试验
精密称取同一批号白花蛇舌草粉末约1.0g，按“2.3”项下方法制备，按上述色谱条件，进 样 20 μl，记录槲皮素和山奈素的峰面积，结果RSD分别为0.91%，1.14%（n＝5），表明 本法重复性较好。
2.9 加样回收率
精密称取已知含量同一批号（2007001）的白花蛇舌草约0.1g，共3份，分别加入同法制备的 白花蛇舌草对照品储备液（槲皮素浓度为1.26μg/ml、山奈素浓度为0.44μg/ml）1.0ml，2 .0ml，3.0ml依“2.3”项下方法处理，按上述色谱条件进行测定，进样量为20 μl，按外标 法计算回收率，结果见表1。
2.10 样品的含量测定
分别取白花蛇舌草药材3批，按“2．3”项下供试品溶液制备方法制备，分别精密吸取对照 品 溶液与供试品溶液各20 μl，按上述色谱条件下测定，每批样品平行测定3次，按照外标法 计算槲皮素和山奈素含量，结果见表2。
3 讨论
3.1 通过对不同甲醇-水比例的流动相进行选择，结果发现槲皮素、山奈素保留时间随甲 醇浓度增大而缩短，加入适量乙腈能达到更好的分离效果，选择乙腈-甲醇-水（10∶45∶ 60）为流动相，分析时间适中，且样品中槲皮素、山奈素达到良好的分离。
3.2 采用水浴回流提取与超声提取进行比较，结果水浴回流提取中槲皮素和山奈素的含 量明显高于超声提取，故选择水浴回流提取法。
参考文献：
［1］ 郑宏钧，詹亚华．现代中药材鉴别手册［M］．北京：中国医药科技出版 社，2001：798．
［2］ 孙也之，王琳，刘振，等.高效液相色谱法测定白花蛇舌草中槲皮素含 量［J］.广东药学院学报，2007，23（1）：5-6
(收稿日期： 2008-01-20)
［责任编辑 王慧瑾 邓德灵］
