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[摘要] 目的:探讨P16和Ki-67在外阴上皮内瘤变（VIN）组织中的表达及其意义。方法：采用免疫组化SP法检测44例VIN（VINⅠ16例，VINⅡ、Ⅲ 28例）组织中P16和Ki-67的原位表达，并以30例正常外阴组织作为对照。结果：对照组、低级别VIN（VINⅠ）和高级别VIN（VINⅡ、Ⅲ）组织中P16的阳性率依次为7%、44%和100%，Ki-67的阳性率依次为10%、75%和100%；P16和Ki-67在VINⅡ、Ⅲ和对照组，VINⅡ、Ⅲ和VINⅠ之间的阳性表达率差异均具有统计学意义（P＜0.01）。若将P16阳性表达界定为中和（或）上1/3外阴上皮细胞弥漫阳性着色、Ki-67阳性界定为下1/3外阴上皮以上大于或等于25%的上皮细胞胞核阳性着色，作为鉴别高级别VIN的标志物，P16的敏感性、特异性分别为93%、93%，Ki-67的敏感性、特异性分别为96%、85%。结论：P16和Ki-67在对照组、低级别VIN与高级别VIN组织中的表达有显著差异，可较敏感地鉴别出高级别VIN。采用二者联合标记，更能有效地降低假阳性病例的干扰，提高VIN诊断的特异性。
［关键词］ 外阴上皮内瘤变； P16； Ki-67； 免疫组织化学； 表达
［中图分类号］ R711.72; Q786 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1671-7562（2011）01-0028-05
doi:10.3969/j.issn.1671-7562.2011.01.省略
Expression and significance of P16 and Ki-67 in differential diagnosis
of high-grade and non-high-grade vulvar intraepithelial neoplasia
WANG Wen-zhong1， LI Dai-qiang2
（1. Department of Pathology, the People"s Hospital of Xiangxiang, Xiangxiang 411400, China； 2. Department of
Pathology, Xiangya Second Hospital of Zhongnan University, Changsha 410011, China）
[Abstract] Objective: To investigate the effects of P16 and Ki-67 on vulvar intraepithelial neoplasia（VIN）. Methods: The expression of P16 and Ki-67 in situ in the lesion of 44 patients［16 low-grade VIN（VIN Ⅰ）, and 28 high-grade VIN（VINⅡand Ⅲ）］ were examined by immunohistochemical assay；and 30 normal vulvar tissues were treated as controls. Results: The positive percentages of P16 in normal vulvar tissues, VIN Ⅰ,Ⅱ, Ⅲ were 7%,44%,100% respectively; The positive percentages of Ki-67 in normal vulvar tissues, VIN Ⅰ,Ⅱ, Ⅲ were 10%，75%，100% respectively. The expressions of P16 and Ki-67 had significant differences between the high grade and low grade VIN（P＜0.01）. When positive P16 staining was defined as the presence of diffuse/continuous staining in more than one-third of the thickness of epithelium, the sensitivity and specificity of P16 as a marker for diagnosing high-grade VIN were 93%, 93%, When positive Ki-67 staining was defined as the presence of nuclear staining in more than 25% of the cells in more than one-third of the thickness of epithelium, the sensitivity and specificity of Ki-67 as a marker for diagnosing high-grade VIN were 96%, 85%. Conclusions: Both P16 and Ki-67 are reliable markers for diagnosing high-grade VIN.
[Key words] vulvar intraepithelial neoplasia； P16； Ki-67； immunohistochemistry； expression
外阴上皮内瘤变（intraepithelial neoplasia,VIN）是指发生在外阴上皮内的一组癌前病变，可分为VIN Ⅰ、VIN Ⅱ及VIN Ⅲ［1］，其中VIN Ⅲ复发率高，38%的患者治疗后复发，15%～25%的患者可进展为浸润性鳞状细胞癌［2］。准确地诊断出高级别VIN对病人的治疗和预后具有十分积极的意义。
长期以来对VIN的诊断主要依靠病理科医生对组织切片的光镜观察，判断带有一定的主观性，同时由于取材的局限性，诊断误差较明显。P16和Ki-67已被观察到可较特异和敏感地鉴别不同级别宫颈上皮内瘤变（CIN）［3］和阴道上皮内瘤变（AIN）［4］，但其在VIN临床诊断中的价值国内外少有报道。本研究的目的在于观察P16和Ki-67在不同级别VIN中的表达，探讨其在VIN诊断中的临床意义。
1 资料与方法
1.1 资料
收集中南大学湘雅二医院病理科和湘乡市人民医院病理科2005至2007年外阴活检标本和局部手术切除标本共74例（年龄19～65岁，平均年龄45岁，中位年龄42岁），其中中南大学湘雅二医院病理科62例，湘乡市人民医院病理科12例。所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。VIN的病理分级按文献［5］标准进行：正常30例（40.5%），低级别VIN（VIN Ⅰ）16例（21.6%），高级别VIN（VIN Ⅱ、Ⅲ）28例（37.8%）。
1.2 试剂
Ki-67兔单克隆抗体、P16鼠单克隆抗体均购于福州迈新生物技术公司，SP试剂盒为Dako公司产品。
1.3 方法和结果判断
免疫组织化学按SP法进行染色，具体操作按说明书进行。用AEC显色，光镜下控制显色时间，流水终止反应；常规脱水，水溶性封片。
Ki-67以细胞核出现红色颗粒状物为阳性着色。由于正常的鳞状上皮基底层细胞Ki-67呈阳性表达，实验仅观察基底层以上的上皮细胞的阳性率，≥10%为阳性病例。同时按Ki-67阳性率10%～25%、26%～50%、＞50% 3个级别进行统计分析。
P16以细胞质和（或）细胞核出现红色颗粒状物为阳性着色，P16免疫标记分为阴性、不连续的灶性阳性着色（且阳性细胞≤10%）和连续的弥漫的阳性着色（且阳性细胞＞10%）。
1.4 统计学处理
观察P16和Ki-67的阳性率和阳性表达方式，比较P16和Ki-67标记结果在高级别VIN与正常组、高级别VIN与低级别VIN组之间的差异，采用SPSS 10.0统计软件包进行处理，行t检验，同时确定P16和Ki-67作为高级别VIN标志物的特异性、敏感性。
2 结 果
2.1 P16标记结果
见表1。
P16在高级别VIN组中的表达与正常组及低级别VIN组比较，P＜0.01。正常组外阴上皮93.3%（28/30）的标本P16无着色，仅有6.7%（2/30）的标本上皮呈局灶性的P16阳性着色，且阳性细胞均分布于鳞状上皮下1/3，未见中1/3和上1/3弥漫着色的病例。
表1 VIN组织中P16的表达例
低级别VIN者56.3%（9/16）的标本P16呈现阳性，25.0%（4/16）的标本P16阳性染色阳性细胞位于上皮的下1/3，主要呈现灶性片状阳性着色；只有18.8%（3/16）的标本呈现较弥漫着色（图1）。高级别VIN标本P16均呈阳性着色，92.9%（26/28）的高级别VIN标本P16阳性着色超过上皮1/3,主要呈弥漫阳性着色（图2）。P16的阳性表达率在高级别VIN组与正常组、高级别VIN组与低级别组之间差异均具有显著统计学意义（P＜0.01）。
Ki-67在高级别VIN组中的表达与正常组及低级别VIN组比较，P＜0.01。正常组90.0%（27/30）的标本上皮Ki-67无着色，2例上皮Ki-67阳性着色且阳性细胞分布于鳞状上皮的下1/3，1例上皮Ki-67阳性细胞分布于鳞状上皮的下1/3以上。
低级别VIN组有37.5%（6/16）的标本Ki-67阳性细胞大于25%，且阳性细胞分布于上皮下1/3以上（图3）。所有高级别VIN者Ki-67均呈阳性，其中96.4%（27/28）的标本阳性细胞数大于25%，且分布到上皮中或上1/3（图4）。Ki-67的阳性表达率在高级别VIN组与正常组、高级别VIN组与低级别组之间差异均有显著统计学意义（P＜0.01）。Ki-67的阳性表达率在低级别VIN组与正常组之间差异不具有统计学意义（P＞0.01）。
图1 低级别VIN组织中P16呈现上皮下1/3不连续的片状胞质或胞核红色着色 SP法×100图2 高级别VIN（VIN Ⅲ）组织中P16呈上皮全层连续的胞质或胞核红色着色 SP法×100
图3 低级别VIN组织中Ki-67呈上皮下1/3细胞核红色着色 SP法×100
图4 高级别VIN组织中Ki-67呈上皮全层细胞核红色着色 SP法×100
2.2 Ki-67的标记结果
见表2。
2.3 P16与Ki-67作为高级别VIN标志物的意义
见表3。
表2 VIN组织中Ki-67的表达例
表3 免疫标志物P16、Ki-67在正常组织和不同级别VIN组织中的表达特点
注：P16阳性表达定义为中1/3和（或）上1/3上皮细胞的弥漫的阳性着色；Ki-67阳性表达定义为下1/3以上的上皮细胞大于或等于25%的细胞核阳性着色
通过对比高级别VIN组与低级别VIN组的P16、Ki-67标记结果发现，若将P16阳性表达界定为中1/3和（或）上1/3外阴上皮细胞弥漫阳性着色、Ki-67阳性界定为下1/3以上的上皮细胞大于或等于25%的细胞核阳性着色，P16和Ki-67在高级别VIN组与低级别VIN组之间的表达存在显著的统计学差异（P＜0.01）。作为鉴别高级别VIN的标志物P16的敏感性、特异性分别为93%、94%，Ki-67的敏感性、特异性分别为93%、85%。
3 讨 论
研究证实，VIN的发病机制与人类乳头状瘤样病毒（HPV）感染有关［6］。HPV所含有的E6、E7基因可整合入宿主的基因组内，进而分别引起P53、Rb蛋白的功能失调，使上皮细胞的细胞周期发生紊乱，造成Rb通路失控，引起原本正常的细胞增殖蛋白包括Ki-67、P16蛋白的异常表达［7］。
P16是一种肿瘤抑制蛋白，属于细胞周期素依赖激酶抑制蛋白。HPV感染的细胞pRb失活，使pRb负反馈调节细胞内P16水平的作用消失，P16表达增加。细胞增殖活性可通过检测Ki-67核抗原的表达水平进行评估，高危型HPV感染可导致上皮细胞增殖活跃。
本实验结果显示，正常外阴上皮、低级别VIN和高级别VIN组织中P16的阳性率分别为7%、44%和100%，Ki-67的阳性率分别为10%、75%和100%，可见P16和Ki-67在不同级别VIN组织中的表达均有显著性的差异。实验结果还观察到：高级别VIN上皮P16阳性细胞百分率高，主要呈弥漫阳性着色，阳性细胞分布于下1/3上皮以上，低级别VIN上皮中P16阳性细胞少，主要呈灶性片状阳性，阳性细胞位于上皮的下1/3；Ki-67在高级别VIN组织中的阳性细胞分布于上皮中或上1/3，而低级别VIN组织中Ki-67阳性细胞分布于上皮下1/3。采用P16和Ki-67标记外阴组织，可有效地鉴别正常组织、低级别VIN与高级别VIN组织。
尽管这两种标志物均可有效地检出高级别VIN，但每种标志物的应用都有其局限性。作为高级别VIN的标志物，P16的特异性为93%，比Ki-67（为87%）高，敏感性为93%，比Ki-67（为96%）稍低。本实验收集的30例正常病例标本中，有3例Ki-67呈阳性着色，其中2例阳性数小于25%，细胞分布于上皮下1/3，根据高级别VIN中Ki-67呈阳性的判断标准，此类病例应判断为阴性。1例阳性数大于25%，且分布于上皮下1/3以上，回顾该病例的组织切片，发现其真皮表面出现较重的炎症反应，可能由于组织进行反应性的修复，导致细胞增生活跃。由此可见，仅用Ki-67标记，不能完全将反应增生与VIN区别开。30例正常病例中，P16染色虽有3例表现为灶性阳性着色，但阳性细胞均分布于上皮下1/3，根据高级别VIN中P16阳性的判断标准，此类病例判断为染色阴性，因此P16在正常组中的表现为阴性反应。可见若Ki-67联合P16进行标记，可降低假阳性率，提高判断的准确性。我们在高级别VIN的判断标准中加入中1/3和（或）上1/3上皮细胞的弥漫阳性着色视为P16阳性，下 1/3以上的上皮细胞大于或等于25%的细胞胞核阳性着色视为Ki-67阳性，提高了P16、Ki-67作为鉴别高级别VIN的特异性。
对VIN的常规病理组织学诊断，由于缺乏绝对的诊断标准，受主观因素影响较大，导致病理形态学诊断的可重复性相对较差。同时受送检标本上皮完整性、组织局限性等因素影响，VIN的病理诊断较困难。此类疾病的诊断不足或过诊断，可导致疾病延迟治疗或过治疗，而P16、Ki-67检测为诊断提供了有效的客观参考指标，有助于提高诊断的准确性。
本研究结果显示：P16和Ki-67在外阴上皮正常组织、低级别VIN与高级别VIN组织之间的阳性表达率具有显著性差异，可敏感地鉴别出高级别VIN；采用二者联合标记，更能有效地降低假阳性病例的干扰，提高VIN诊断的特异性。
［参考文献］
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