【www.zhangdahai.com--常用文书】
【摘要】 目的 建立芪参益智胶囊的质量标准。方法 采用薄层色谱法对芪参益智胶囊中党参、枸杞子、陈皮等进行定性鉴别;采用高效液相色谱法测定黄芪甲苷的含量。色谱柱:Agilent Hypersil ODS十八烷基键合硅胶柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:乙腈-水(32∶68);流速:1.0 ml/min;漂移管温度:45℃;气体流速:1.5 L/min。结果 定性鉴别薄层色谱斑点清晰,阴性无干扰;黄芪甲苷在0.506~4.554 μg范围内呈良好线性关系;平均回收率为103.05%,RSD为1.43%(n=6)。结论 该方法简便、准确、可靠,可作为芪参益智胶囊的质量控制方法。
【关键词】 芪参益智胶囊;质量标准;薄层色谱法;高效液相色谱法;黄芪甲苷
Studies on the quality standard of qishenyizhi capsule
XIAO Xin-jian.Department of T.C.M,Tai’an City Hospital,Tai’an 271000,China
【Abstract】 Objective To establish the quality standard of qishenyizhi capsule.Methods TLC were used to distinguish Dangshen、Pugongying、Zhizi and Chishao. HPLC were used for the deterimination of Berberine. The column was PHENOMENEX ODS C��18�(4.6 mm×250 mm,5 μm);the acetonitrile-water(35:65)as mobile phase,the flow ratewas 1.0 ml/min,the temperature of drift tube was 45℃ and the flow rate of gas was 1.5 L/min. Results The thin-layer chromatography spots were clear and the negative samples and had no interferences;and Astragaloside Ⅳshowed good linearity in the range of 0.506-4.554 μg, and the average recovery was 103.05% with RSD 1.43%(n=6).Conclusion This method is simple,accurate,reliable and can be used as a quality control method for qishenyizhi Capsule.
【Key words】 Qishenyizhi capsule;Quality standard;TLC;HPLC;Astragaloside Ⅳ
芪参益智胶囊由黄芪、党参、枸杞子、陈皮等药物组成,具有益气复脉,养阴生津的功效,主要用于气血两虚,心悸气短,脉微虚汗等[1]。为控制芪参益智胶囊的质量,采用薄层色谱法对该制剂中的党参、枸杞子、陈皮等药材进行了定性鉴别;并采用高效液相色谱法对制剂中的黄芪甲苷进行了含量测定,从而有效地控制芪参益智胶囊的内在质量。
1 仪器与试药
瑞士 CAMAG Automatic TLC Sampler4(薄层自动点样仪),瑞士CAMAG Reprostar3(薄层成像系统),硅胶G 薄层板(浙江省路桥四甲生化塑料厂),Agilent 1200高效液相色谱仪,Alltect 3000蒸发光散射检测器,四元梯度泵,Agilent Hypersil ODS十八烷基键合硅胶柱[2]。
试剂:乙腈为色谱纯,水为双蒸水,其他试剂均为分析纯。党参对照药材(121057-200504)、枸杞子对照药材(121072-200505)、陈皮对照药材(120969-200507)、黄芪甲苷对照品(110781-200613)均购于中国药品生物制品检定所。芪参益智胶囊(自制中试产品,批号:091022,091023,091024),芪参益智胶囊阴性(自制)。
2 定性鉴别
2.1 党参的TLC鉴别 取本品内容物5 g,加水饱和的正丁醇30 ml,超声处理30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇5 ml使溶解,作为供试品溶液。另取党参对照药材1 g,加水适量湿润,再加正丁醇10 ml,超声处理15 min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1 ml使溶解,作为对照药材溶液。再按处方比例,取缺党参的其他各味药,按制备工艺加工制成阴性样品,按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典一部附录Ⅵ B)试验,吸取上述溶液各10 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20�∶�4�∶�0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性无干扰(如图1)。
2.2 枸杞子的TLC鉴别 取本品内容物5 g,加水30 ml,超声处理15 min使溶解,加三氯甲烷萃取2次,20 ml/次,合并三氯甲烷液,蒸干,残渣加甲醇2 ml使溶解,作为供试品溶液。另取枸杞子对照药材2 g,加水30 ml加热回流30 min,滤过,滤液加三氯甲烷萃取2次,20 ml/次,同法制成对照药材溶液。再按处方比例,取缺枸杞子的其他各味药,按制备工艺加工制成阴性样品,按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典一部附录Ⅵ B)试验,吸取上述溶液各10 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(3�∶�7�∶�0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的荧光斑点,阴性无干扰(如图2)。
2.3 陈皮的TLC鉴别 取“2.1”项下供试品溶液作为供试品溶液。另取陈皮对照药材1 g,加水20 ml加热回流30 min,滤过,滤液加水饱和正丁醇萃取2次,20 ml/次,合并正丁醇液,蒸干,残渣加甲醇1 ml使溶解,作为对照药材溶液。再按处方比例,取缺陈皮的其他各味药,按制备工艺加工制成阴性样品,按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液[3,4]。照薄层色谱法(中国药典一部附录Ⅵ B)试验,吸取上述溶液各5 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯(3�∶�2)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的荧光斑点,阴性无干扰(如图3)。
1～3、供试品 4、党参对照药材 5、空白对照
1～3、供试品 4、枸杞子对照药材 5、空白对照
1～3、供试品 4、陈皮对照药材 5、空白对照
3 含量测定
3.1 色谱条件 色谱柱:Agilent Hypersil ODS十八烷基键合硅胶柱;流动相:乙腈-水(32�∶�68);柱温:25℃;流速:1.0 ml/min;漂移管温度:45℃;气体流速:1.5 L/min。
3.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芪甲苷对照品25.30 mg,置50 ml量瓶中,加甲醇使溶解并稀释至刻度,摇匀,制成每1 ml含黄芪甲苷0.506 mg的对照品溶液,即得。
3.3 供试品溶液的制备 取本品约6 g,研细,精密称定,加甲醇40 ml加热回流4 h,提取液蒸干,残渣加水10 ml,微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取4次,40 ml/次,合并正丁醇液,用氨试液洗涤2次,40 ml/次,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣加水5 ml使溶解,放冷,通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5 cm,柱高12 cm),以水50 ml洗脱,弃去水液,再用40%乙醇30 ml洗脱,弃去洗脱液,继用70%乙醇80 ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,用甲醇溶解并转移至5 ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
3.4 阴性对照试验 处方中除去黄芪,按制剂工艺制备,制得供试品阴性对照样品,按供试品溶液制备的方法制备供试品阴性对照溶液。吸取上述溶液各5 μl,分别按上述色谱条件进样分析,记录色谱图,结果显示,阴性对照图谱与对照品、供试品图谱中黄芪甲苷相应的保留时间无色谱峰,表明选择性良好,阴性无干扰。
3.5 标准曲线的制定 取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成不同浓度的黄芪甲苷对照品溶液,再分别精密吸取不同浓度黄芪甲苷对照品溶液(每1 ml中含黄芪甲苷分别为0.101 2 mg,0.303 6 mg,0.506 0 mg,0.708 4 mg,0.910 8 mg)5μl进行色谱测定,按上述色谱条件测定峰面积,并以峰面积的自然对数值(Y)对进样量的自然对数值(X)进行线性回归,得标准曲线。Y=1.691 4X+4.716 7, r=0.999 8,表明黄芪甲苷在0.506~4.554 μg范围内呈线性关系。
3.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液(0.506 mg/ml)5 μl重复进样6次,测得峰面积积分值RSD为0.56%,表明仪器精密度良好。
3.7 重复性试验 按拟定的含量测定方法,对同一批样品(批号:091022)分别制备5份供试品溶液,进样5 μl,测得峰面积并计算含量,结果黄芪甲苷平均含量为0.3894 mg/g,RSD为1.49%,结果表明方法的重复性较好。
3.8 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号:091022),分别于0、2、4、6、8 h进样5 μl,结果测得样品中黄芪甲苷峰面积的RSD(n=5)为1.78%,表明供试品8 h内稳定。
3.9 加样回收率试验 取已知含量的样品(批号:091022)内容物约3.5 g,精密称定,分别精密加入一定量的黄芪甲苷对照品,按供试品制备与测定方法平行试验,结果黄芪甲苷平均回收率为103.05%,RSD为1.43%(n=6),结果见表1。
表1
黄芪甲苷回收率测定结果
序号样重(g)样品中黄芪�甲苷的量(mg)加入黄芪�甲苷的量(mg)黄芪甲苷的�检出量(mg)回收率(%)平均值(%)RSD(%)
13.424 381.333 391.0682.432 82102.94103.051.43
23.485 691.357 261.0682.460 75103.32
33.465 281.349 311.1862.580 60103.82
43.452 611.344 381.1862.576 96103.93
53.486 261.357 481.4202.835 82104.11
63.485 531.357 201.4202.779 57100.17
3.10 样品含量测定 分别精密吸取对照品溶液2、10 μl,供试品溶液5 μl,按上述色谱条件测定,结果见表2,图4~6。
表2
样品含量测定结果(n=2)
批号黄芪甲苷含量(mg/g)RSD(%)
0910220.385 641.15
0910230.402 331.21
0910240.381 261.08
图4 黄芪甲苷对照品溶液HPLC图
图5 供试品溶液HPLC图
图6 阴性溶液HPLC图
3 小结
3.1 本品为一多种中药配制而成的中药复方制剂,成分较为复杂,干扰成分多,采用文中所述方法,采用氨试液洗涤及过柱纯化处理样品,可有效减少干扰,且色谱峰分离度好。
3.2 方中黄芪主要有效成分黄芪甲苷常作为黄芪原药材及含黄芪制剂的质量控制的指标成分。黄芪甲苷在紫外检测条件下为末端吸收,灵敏度低,干扰较大,重复性较差。采用HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷的含量,灵敏度、稳定性及重复性均能符合要求,是一种良好的测定含黄芪甲苷制剂的含量测定方法。
参 考 文 献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部,北京:化学工业出版社,2005:52.
[2] 刘惠珍. HPLC-ELSD法测定胃疡灵颗粒中黄芪甲苷的含量. 中国药师,2009,12(1):79.
[3] 李妍,吴庆淼,朱艳宇. HPLC-ELSD测定醒脑再造胶囊中黄芪甲苷的含量. 中国中医药信息杂志,2009,16(4):45.
[4] 张俐,王玉,李争艳.高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定玉屏风胶囊中黄芪甲苷的含量. 化学分析计量,2009,18(1):22.
