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[摘要] 目的 运用活体质子磁共振波谱法研究听觉剥夺大鼠下丘脑组织代谢变化,探讨听觉中枢可塑性的可能分子机制。方法 选取8只雄性SD大鼠,应用高场强MRI(7.0 T)微磁共振波谱仪行�1H磁共振波谱(�1H-MRS)分析,每只大鼠做2次MRS扫描:第1次对正常大鼠扫描作为自身对照,第2次在听觉剥夺(双侧耳蜗切除)后第4 d进行。采集感兴趣区(ROI)左侧下丘脑内波谱,分析该区N-乙酰天冬氨酸/肌酸(NAA/Cr)和胆碱/肌酸(Cho/Cr)值的变化。结果 听觉剥夺大鼠左侧下丘脑组织Cho/Cr值(0.637±0.044)显著低于听觉剥夺前(0.764±0.062,t=4.800,P0.05)。结论 �1H-MRS可以在活体状态下用于研究听觉中枢系统的组织代谢变化,Cho/Cr比值下降可能是听觉剥夺后下丘脑神经元损伤的早期标志。
[关键词] 听觉剥夺;下丘脑;磁共振波谱法;大鼠
[中图分类号] R816.96;R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1671-7562(2009)05-0339-04
听觉中枢像其他感觉系统一样具有可塑性,外周听器损伤后听觉中枢产生从基因水平到系统功能的广泛的变化。磁共振波谱(magnetic resonance spectroscopy,MRS)是目前唯一可以用来在活体无损伤状态下检测细胞水平代谢变化的非侵入性技术。20世纪70年代中期MRS就已应用于人和动物组织器官的活体检测,近年来随着MRS技术的迅速发展和美国FDA对MRS技术的认可,MRS已从实验室研究转入临床应用阶段。它的应用对了解各种疾病的生化、病理生理变化以及对临床诊断、判断疾病预后及治疗效果均有非常重要的意义[1-2]。
本实验利用高场强Bruker 7.0 T微磁共振波谱仪,在活体状态下对正常及听觉剥夺大鼠左侧下丘脑组织进行�1H磁共振波谱(�1H-MRS)分析,检测其代谢物质的含量及变化,以探讨听觉中枢可塑性的可能分子机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物选择
8只正常健康雄性SD大鼠(由东南大学医学院实验动物中心提供),体重300~350 g,无中耳感染,行听觉脑干反应(ABR)检测,排除双耳听阈大于45 dB。
1.2 听觉剥夺动物模型
参照文献[3]中的方法:1%戊巴比妥钠(40 mg•kg-1)腹腔麻醉,在体视显微镜下做耳后1～2 cm长切口,钝性分离暴露听泡,去除听泡骨壁直到完全看清耳蜗结构,钩针机械破坏耳蜗各回,庆大霉素冲洗后缝合切口。术后行ABR测试,ABR未引出证明造模成功。在温热板上保护大鼠直至完全从麻醉中清醒,随后送至笼中饲养。
1.3 ABR检测方法
测试在隔音屏蔽室进行,室温(20±2) ℃,1%戊巴比妥钠(40 mg•kg-1)腹腔麻醉,麻醉生效后安插针式电极,记录电极刺入前颅顶正中穿透皮肤至颅骨骨膜,置于冠状缝中点处,同时给声耳及对侧耳后皮下分别刺入参考电极和接地电极。TDH-39型耳机给声,声源距耳廓1 cm,诱发电位用信号处理机叠加处理,测试时刺激声为交替短声(clicks),重复率10次•s-1。实验选用主要参数:带道滤波为32 Hz~3 kHz,扫描时间为10 ms,叠加为512次。测试声强由110 dB SPL开始,接近阈值后按5 dB SPL逐档递减,电生理反应由针式电极引出,经放大及处理后以波形的方式显示于荧光屏,阈值以肉眼刚能辨认的脑干电位波群中Ⅲ波的声强表示。
1.4 �1H-MRS分析
1.4.1 麻醉与固定 麻醉成功后将大鼠头部固定在特制的有机玻璃立体定向仪的支架上,并进行心跳和呼吸监测。
1.4.2 MRI 实验在德国Bruker 7.0 T(Pharma Scan 70/16)微磁共振波谱仪上(江苏省分子与功能影像重点实验室)进行。采用T�2加权像扫描,TR 4 200 ms,TE 36 ms,扫描层厚1.0 mm,层间距1.2 mm,累积(NOA)1次,每次1个回波。自嗅球向后共扫描15个层面,获得冠状位MR定位图像。
1.4.3 �1H-MRS 参考《大鼠脑立体定位图谱》,在MRI图像上选定左侧下丘脑作为感兴趣区(ROI)采集信号(图1)。�1H局域谱采用点分辨波谱(PRESS)序列,TR 2 500ms,TE 20 ms,采集次数500次,采集体积3 mm×3 mm×3 mm,水抑制采用VAPOR。对测量所得自由衰减信号(FD)进行傅利叶转换得到�1H-MRS,应用仪器自身软件对波谱进行相位校正和基线修正,观察N-乙酰天冬氨酸(NAA)、胆碱(Cho)及肌酸(Cr)等信号强度改变,计算NAA/Cr和Cho/Cr值。
1.5 统计学处理
数据以x±s表示,利用SPSS 11.0统计软件对测量的结果进行配对t检验,P,t=4.800,P±0.057,1.235±0.082)差异无统计学意义(t=1.265,P>0.05)。见表1。
3 讨论
许多研究表明,不同发育阶段,听力损失导致听觉中枢功能改变的同时,其结构形态�物质代谢�神经递质、相关基因及酶等也发生了变化。表现为兴奋性和抑制性神经递质及其受体的表达升高或降低,突触结构和活性的改变,神经细胞凋亡,突触后电流及许多细胞分子改变[4]。这一过程是多重因素共同作用的结果,它们在这一过程中的相互作用、相互联系,以及它们在听觉中枢重组中起到怎样的作用,还有待进一步研究。下丘核(inferior colliculus,IC)是最重要的听觉中枢皮层下汇聚站,它在声音频率、强度、时间因素及声源定位的分析中均起着重要的作用,并受多种因素的影响[5];而且大鼠的下丘脑在中枢听觉传导通路中相对体积较大,MRI较易识别定位,因此本实验选择下丘脑作为测量的感兴趣区。
�1H-MRS检查是一种评价体内组织和器官生化和代谢特征的非侵袭性检查方法,能提供细胞能量代谢、膜转运、神经元功能、选择性的神经递质活动等方面的信息。位于波谱2.02 ppm的信号主要由NAA构成,被公认为是神经元的标记物。位于波谱3.02 ppm的信号由Cr和磷酸肌酸构成,是能量代谢的关键产物;因为Cr的浓度在各种状态(包括病理状态)下相对稳定,所以许多波谱研究均将Cr当作内参照,在一定程度上反映了代谢状态的变化。NAA与Cr的比值即相对定量可作为反映神经元功能的指标,其比值降低是神经元数量缺少和功能障碍的标志[6]。Aydin等[7]的研究显示,音乐家左侧颞平面NAA浓度比未经过音乐训练者高,差别显著;Cho和Cr浓度差别不显著;并认为NAA浓度增加可能是局部神经元密度增加的结果。长期的专业音乐训练可导致神经代谢物浓度的显著变化,这可能反映了音乐家大脑使用依赖性(use-dependent)调整的生理机制。本实验检测听觉剥夺大鼠下丘脑组织中NAA/Cr未见明显变化,这可能是由于急性期神经元结构尚完整,未发生明显形态学变化。
Cho主要位于波谱3.21 ppm处,其含量反映了细胞膜的合成与转运状态,Cho峰主要由胆碱及其代谢物甘油磷酰胆碱、磷酸胆碱和磷脂酰胆碱组成,参与构成细胞膜,而且是神经递质乙酰胆碱(ACh)的前体,影响记忆、认知和精神状态。Cho是细胞膜磷脂代谢的一个组成成分且反映细胞膜的更新。本项研究显示下丘脑组织中Cho/Cr明显下降。而Cho信号下降可能表明细胞膜的合成更新变慢、神经元功能状态下降、细胞间的信号传递机制受损以及细胞的密度下降[8-10];Cho信号下降亦可能是因为神经细胞合成ACh减少,对Cho需要量下降所致。有研究[11]证明ACh参与听觉中枢的可塑性变化。应用毒蕈碱样ACh受体阻断剂研究发现,内源性ACh对IC和听皮层(auditory cortex,AC)中最佳频率(best frequency,BF)的可塑性改变是必需的[12]。由此推测本组大鼠双侧耳蜗切除后4d下丘脑组织中可能发生了上述类似的变化。
我们的结果与Chan等[13]研究青光眼大鼠模型视皮层内的变化一致,他们认为Cho信号下降很可能是由于视皮层功能活性下降、突触变性、ACh释放减少、视觉通路的胆碱能系统功能障碍所引起;并推测神经元丧失之前其细胞膜的结构组成首先发生了变化。
各种原因的听力损失可塑性变化是相似的,在发育期间和成年后都可发生。对这些变化的发现和认识,将对包括听觉中枢在内的中枢神经系统功能和听觉机制的认识具有重要意义。阐明大脑发育及其如何保持最佳功能状态的机制,将可能促进助听器和人工耳蜗植入后听觉功能康复的新发展。本实验只是对大鼠急性听力剥夺后下丘脑物质代谢变化的一个初步探讨,旨在观察听觉中枢是否会产生相应的改变,今后的试验将会对听力剥夺后的不同时间段、不同部位的听觉中枢进行系列连续的观察。
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[收稿日期] 2009-04-07
