【www.zhangdahai.com--实习报告】
【摘要】 本文阐述了褪黑素(MT)对病毒感染的作用,特别是对委内瑞拉马脑脊髓炎(VEE)的治疗作用,MT也能延长由塞姆利基森林病毒(SFV)接种而引发的疾病,并且能减少因隔离或地塞米松注射而产生应激的西尼罗河病毒(WNV)感染小鼠的死亡率。宿主经由外周免疫刺激而产生活性,对病毒抵抗力的增加与这些作用有关。在VEE感染的小鼠中,MT 延长了疾病的发生和死亡的天数,并且减少了死亡率。在鼠类 VEE 病毒感染中观察到的 MT 的保护作用,并不是 TNF-a 和 INF-r 的作用,而应归功于白细胞介素-1β (IL-1β)的增加。MT 治疗也能提高对 VEE 病毒的免疫作用。活性氧簇能传播病毒,并且其有害作用可以被MT减弱,氧化亚氮在传播 VEE 病毒中起着关键性作用,MT能抑制一氧化氮合成酶(NOS)活性,并且是一种有效的氧化亚氮清除剂。总之,由于 MT 免疫调节作用、抗氧化作用和神经保护作用,表明MT必将成为另一种与病毒类疾病作战的治疗选择。
【关键词】 细胞因子;脑脊髓炎;免疫系统;褪黑素;活性氧簇;病毒性感染
Melatonin and viral infections
YE Ji-yun,YE Ji-min.Department of Microbiology and Immunology of Yunnan Medical college, Kunming 650031, China
【Abstract】 The therapeutic effects of melatonin against viral infections, with emphasis on the Venezuelan equine encephalomyelitis (VEE), are reviewed.Melatonin has been shown to prevent paralysis and death in mice infected with the encephalomyocarditis virus and to decrease viremia. Melatonin also postpones the onset of the disease produced by Semliki Forest virusinoculation and reduces the mortality of West Nile virus-infected mices tressed by either isolation or dexamethasone injection. An increase in the host resistance to the virus via a peripheral immunostimulatory activity is considered responsible for these effects. It has also been demonstrated that melatonin protects somestrains of mink against Aleutian disease, and prevents the reduction of B- and T-cells as well as Th1 cytokine secretion in mice infected with leukemia retrovirus. In VEE-infected mice, melatonin postpones the onset of the disease and death for several days and reduces the mortality rate. This protective effect seems to be due to the increase in the production of interleukin-1b (IL-1β), as 100% of the infected mice treated with melatonin die when IL-1β is blocked with antimurine IL-1b antibodies. Although melatonin administration raises serum levels of tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) and interferon-gamma (IFN-c), the mortality observed in neutralization experiments with the corresponding anticytokine antibodies, suggests that neither TNF-a nor IFN-c are essential for the protective effect of melatonin on murine VEE virus infection. Melatonin treatment also enhances the efficiency of immunization against the VEE virus. Reactive oxygen species have been implicated in the dissemination of this virus, and their deleterious effects may be diminished by melatonin. This indole inhibits nitric oxide synthetase activity and it is a potent scavenger of nitric oxide, which also plays an important role in the spread of the VEE virus. In conclusion, the immunomodulatory, antioxidant, and neuroprotective effects of melatonin suggest that this indole must be considered as an additional therapeutic alternative to fight viral diseases.
【Key words】 Cytokines;Encephalomyelitis;Immune system;Melatonin;Reactive oxygen species;Virus infection
随着人类生存环境的日益恶化,一些与病毒相关疾病的发生呈逐年上升趋势。1995年在南美爆发的 VEE,2002年在美国爆发的西尼罗河脑炎,2003年爆发的严重急性呼吸器官综合征(SARS),2008年在中国发生的手足口病,构成了对人类健康的威胁,引起人类的极大关注。尤其是SARS的出现,使人们对病毒感染的严重后果有了更深刻的认识,因此寻找具有预防病毒感染作用的药物引起了国内外的关注。褪黑素(melatonin,MT)主要由松果腺合成和分泌的吲哚类激素,具有多种生物活性。自其人工合成并作为保健食品上市以来、国内外掀起MT研究热潮,大量的实验和临床研究证明,由于 MT 的免疫调节作用、抗氧化作用和神经保护作用,表明MT必将成为另一种与病毒类疾病作战的治疗选择。本文仅就近年来国内外有关MT在病毒感染方面的作用做一综述。
1 病毒感染的起源
1995年在南美爆发的 VEE,2002年在美国爆发的西尼罗河脑炎和2003年爆发的严重急性呼吸器官综合征(SARS),2008年在中国发生的手足口病,构成了对人类健康的威胁,需要人类给予关注。VEE 是一种重要的由 VEE 病毒引发的人和马感染的疾病,从20世纪20~70年代,南美数以千万的人、马和驴子感染了此病毒,老鼠感染此病毒,表现为兴奋、运动过度,接着表现为运动减退、麻痹、昏迷和死亡。
西尼罗河脑炎是由 WNV 引起的,由蚊子携带传播的病毒性疾病,患者通常出现头痛、发热、胃肠道症状、斑丘疹和淋巴结病,这种疾病是致命的,尤其是对老年人或免疫低下的患者[1],因发生脑膜炎和脑炎而导致死亡,或因神经学上的缺陷而死亡。
SFV对人类是一种低致病性的虫媒病毒,但是对老鼠却能引起致命的脑炎。SARS患者的呼吸器官分泌物中,分离出一种新的冠形病毒,并且随后证实或通过血清学显示,在其他有此类疾病的患者中,这种病毒表现出了与SARS之间的亲缘关系[2]。在发病初期,病状是类似于流行性感冒,除了重复感染外,体温通常为38℃或更高些、有持续干咳、呼吸困难,并且在低氧血症和高碳酸的血症的情况下,有时会导致急性呼吸窘迫[3]。
手足口病是世界范围广泛流行的传染病,其病原体类型很多,但均属微小核糖核酸病毒科,人肠道病毒属,包括柯萨奇病毒A组5、10、16、19型(CA5、10、16、19)及肠道埃可71病毒(EV71)型和新型肠道病毒,但最常见为CA16及EV71型[4]。不同类型病毒感染,临床表现轻重不一,主要表现为手掌足底部皮疹和口腔疱疹,轻者可无并发症,预后良好。重者可并发心肌炎、中枢神经及多器官功能损害,造成死亡及后遗症[5]。手足口病高发年龄为1～5岁儿童,占82.92%。发病时间有明显季节性,故除夏秋季外,春末夏初也应视为手足口病的多发季节[6]。
2 MT对病毒感染的作用
病毒感染能使全身产生免疫抑制。Maestroni等[7]证实 MT 能保护机体免受病毒性脑炎的损害,他证实 MT 能预防急性应激后脑炎心肌炎病毒感染小鼠的麻痹和死亡。Ben-Nathant等[8]报道了给予 MT (接种 SFV 后3 d前给予 MT,接种后继续给予 MT 至10 d)能减少病毒血症并能有效地延缓发病7～10 d。MT 能减少 SFV (10 pfu)接种小鼠的死亡率,使其从100%减少至60%;若接种较高剂量的SFV(100 pfu),MT减少其死亡率的机率仅为20%。在幸存的小鼠中,于病毒接种后的第22天,能检测出抗-SFV抗体。因隔离或地塞米松注射而产生应激的WNV感染小鼠的死亡率分别为75%和50%,给予MT能减少其死亡率分别为30%或25%。
已经知道,MT可以保护野生的或半野生的和杂交品系的水貂免受阿留申病的感染。阿留申病是由持久的微小病毒科病毒感染而产生的,它引发了明显的高丙种球蛋白血病和免疫复合物介导的对肝、肾、肺、动脉的损害[9]。
雌性C57BL/6小鼠感染了LP-BM5白血球过多症逆转录病毒,从而引发鼠类获得性免疫缺陷综合征,这种感染阻止了Th1细胞因子的释放,刺激了Th2细胞因子的分泌,增加了肝脏的脂质过氧化反应,并诱发了VE的缺乏。Zhang等[10]报道使用脱氢表雄酮或MT,单独或混合治疗能防止B和T细胞增殖的减少,和由逆转录病毒感染引起的Th1细胞因子分泌的减少,这些激素也能抑制Th2细胞因子的升高,减少肝脏的脂质过氧化反应,并防止VE的降低。
3 MT对VEE病毒感染的作用
3.1 MT保护感染VEE病毒的小鼠 给予MT能保护感染VEE病毒的小鼠,当病毒接种(10 LD50/鼠)后大约6 d,使用MT 250、500、1000 μg/kg治疗小鼠感染时,其死亡率与感染对照组小鼠死亡率100%比较,分别为45%、40%和16%。另外,MT治疗能延缓疾病的发生和延长治疗小鼠的死亡时间,在接受MT治疗的幸存小鼠中,病毒接种后7 d,可以明显地提高VEE病毒IgM抗体滴度[11]。与感染对照组相比,给予MT能显著降低血和脑中的病毒水平,与预治疗3 d的标准成活率60%相比,小鼠用MT预治疗10 d后,可以看到能显著增加小鼠的成活率73%。在用VEE病毒连续稀释的鸡胚胎成纤维细胞的培养中,MT能显著减少对细胞破坏的程度,此发现与Ben-Nathan等[8]报道的是有差异的。Ben-Nathan认为在组织培养中,MT不会影响SFV的生长,然而,我们的结果不能排除这种可能性,MT经由外周的免疫刺激作用可以改变宿主对病毒的抵抗力,而不是使病毒复制,像成纤维细胞能产生TNF-a,它的抗病毒效能是大家所公认的[12]。MT不能刺激白介素-2(IL-2)的合成,但能增加IFN-r的血清浓度。在经MT治疗或没有治疗的感染小鼠中,也可以增加血清中IFN-r的水平。MT在脑内对VEE病毒复制的直接或免疫基础作用,表明实际上是接种后5 d产生的,并且在脑内检测不到病毒的存在。
MT也能延长感染VEE病毒的免疫抑制小鼠的生存期[13]。具有免疫功能的正常小鼠仅能提供大约50%的保护作用,表明仍需要MT来诱导小鼠产生更强的免疫保护作用,至少说,免疫系统的完整性能诱导它的保护活性。在免疫抑制小鼠的脑内,MT的缺乏对病毒滴定度的影响,与在免疫活性小鼠的脑内相比,给予MT能减少VEE病毒的水平[11],表明在免疫活性小鼠中通过MT刺激产生的抗病毒机制,在免疫抑制动物中是缺乏的或减弱的。MT所提供的对细胞成分氧化损伤保护作用是有重要意义的,至少说,它能增加免疫抑制小鼠的成活率,在这点上,证实了在干扰素a、β受体(INAR-1-/-)或干扰素调节因子-2(IRN-2-/-)中具有定向缺失的小鼠与对照组小鼠比较,更容易感染VEE病毒。IFNAR-1-/-小鼠与对照组小鼠比较,更易促使VEE病毒分散到血清和脑内。IRF-2-/-小鼠可诱导 NOS因子,但当感染VEE病毒后,不能产生此作用。可以估计,在 NOS产物中有关细胞的作用,认为初级的小神经胶质细胞的培养对VEE病毒的感染是高度敏感的,此外,这种感染增加了在静止期小神经胶质细胞培养中氧化亚氮的水平,却降低了INF-r刺激的小神经胶质细胞中氧化亚氮的产生。这些事实说明,活性氮的种类在VEE病毒的传播中起着关键性的作用[14]。它是一个有趣的现象,MT在体外能抑制小脑内NOS的活性[15]并且是氧化亚氮有效的消除剂[16]。在培养的鼠类巨噬细胞中,发现MT能抑制氧化亚氮产物,这应归功于NOS稳态mRNA水平的减少和NOS在蛋白质中的表达[17]。
3.2 MT减弱VEE病毒的作用与内源性细胞因子的关系 在近来的研究中,发现在治疗小鼠中MT能刺激内源性IFN-r、IL-1β、和TNF-a的产生,但不能刺激IL-2和IL-4的产生。表明MT和IFN-r产生了抗病毒、抗增殖的免疫调节通路和IFN-r的免疫调节活性。这种细胞因子增加了淋巴细胞和巨噬细胞中5-羟色胺和MT的水平。Valero等[18]证实了MT对INF-r的刺激作用,认为用MT进行早期治疗能增加IFN-r的抗病毒活性,并能控制VEE病毒接种时病毒的复制。
在小鼠模型中,由分了无性系VEE病毒感染的细胞因子表达的动力学显示,虽然MT没有增加IL-2或IL-4的分泌,但是因子的表现模式是与IFN-r、IL-6、IL-10、IL-12和INF-r的迅速增加一致,从而起到减弱或杀伤VEE病毒的作用。Valero等[18]的报道确证并延伸了这些发现。
IL-1β和TNF-a对MT比对其他测定的细胞因子更为敏感,在VEE病毒感染期间,治疗后应及早、立刻使用MT及其他细胞因子。MT引起宿主对IL-1β的反应,表明MT在初期御防VEE病毒感染起着重要的作用[18]。这些结果与证实的MT能活化单核细胞,诱导细胞毒素的性质,和IL-1β的分泌是一致的。单核细胞/巨噬细胞不仅对外源MT的刺激敏感,而且也能合成它,因此,这个原因增加了单细胞对感染的反应性。
尽管MT增加了TNF-a和的INF-r的血清水平,但是在中和实验中所得的平均死亡率,与抗细胞因子抗体的实验是一致的,表明在鼠类VEE病毒感染中观察到的MT的保护作用,并不是TNF-a和INF-r的作用[11,18]。实际上,若用抗霉素IL-1β抗体阻断IL-1β时,使用MT治疗的感染小鼠100%都死亡,表明由MT诱导产生的IL-1β可作为一种关键的细胞因子,以促进免疫增强作用,此作用能消除病毒或产生对VEE病毒感染的初期免疫应答。缺乏IL-1β功能因子或使用IL-1β治疗VEE感染小鼠的研究,进一步阐明了MT在感染中所起作用。
3.3 MT增强感染VEE 病毒的神经保护作用使用MT预培养的VEE病毒感染小鼠的存活率,和体外使用相同病毒研究的结果,表明此原因不会产生对VEE病毒的直接影响[18],事实上,在中枢神经系统(CNS)中,脑炎现象更多的应归因于免疫应答的增强,而不是VEE病毒的复制。
VEE病毒感染也能使小鼠脑内TNF-a和IL-1β的水平明显增加,MT刺激内源性IL-1β的产生,并减少感染小鼠脑内TNF-a的浓度。提高脑内IL-1β水平,可以检测出CNS中数种病毒的感染,比如,由于人类免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、SFV、狂犬病毒和辛德比斯病毒引起的那些疾病。然而,这些研究不能表明,IL-1β在CNS病毒感染中所起的是否是保护作用、还是有害作用。Liang等[19]比较了自然历史缺陷病、神经毒性病毒品系的野生型129 SV感染小鼠和神经适应辛德比斯病毒,他们的结果显示,IL-1β缺乏是对致命的辛德比斯病毒感染的保护;相反,IL-1β能增加缺陷小鼠对流感病毒的易感性,并且在痘病毒动物模型中,这种细胞因子的病毒诱导作用也能使宿主获益。
VEE病毒感染的小鼠在用MT治疗后,能检测到血中和脑内增加的IL-1β水平,正如用抗霉素IL-1β抗体阻断IL-1β的作用一样,虽然其作用机制还不清楚,但是在VEE病毒感染期间,含有P物质的某些退化神经元可以释放神经肽,随后诱导单核细胞释放IL-1β和TNF-a,然后从血中渗入CNS。小神经胶质细胞增殖、吞噬局部的神经元碎片,从而使小神经胶质细胞合成IL-1β,然后依次诱导局部内皮吸附分子的表达,顺利地游走于淋巴细胞和单核细胞之间。MT增加IL-1β的水平,是通过星形胶质细胞诱导神经生长因子,从而提供对神经元的支持和保护作用,因此,在应激中应补充许多神经元细胞类型的营养因子,比如,可通过VEE病毒感染产生。
TNF-a对CNS紊乱起正调节作用[20-21],并且与神经元的死亡和生存有关[22-25],它在炎症初期和病理状态下起着重要作用,并用能刺激各种不同细胞类型产生若干细胞因子,包括IL-1β和TNF-a本身。
在VEE病毒感染中,假设通过增加TNF-a在脑内的水平而上调刺激,星形胶质细胞产生集落刺激因子,集落刺激因子能增加炎症反应,由于白细胞的趋化作用,将促进CNS中粒细胞和巨噬细胞向炎症部位迁移。在邻近的上皮细胞中,星形胶质细胞衍生的TNF-a能诱导细胞间的黏附分子,改变血脑屏障的通透性,并且促进炎症渗入CNS[26]。因此,可以合理的假设,在VEE病毒感染的小鼠中,MT能显著降低脑内TNF-a的浓度,且主要是在CNS中减少炎症反应和改变血脑屏障的通透性。所以,MT将有助于保护感染小鼠的大脑。
4 MT对VEE病毒的免疫作用
在用VEE病毒TC-83接种的小鼠中,MT的免疫增强作用是显而易见的。与对照组比较,用MT(1 mg/kg)治疗时,IgM滴定度显著高于接种疫苗后的14 d的水平;用MT(5 mg/kg)治疗时,抗体滴度显著高于免疫1周后的水平[27]。大家公认,IL-10能诱导活性B细胞分泌大量IgA、IgG和IgM抗体。在TC-83接种的小鼠中,若用MT 1 mg/kg和5 mg/kg进行治疗,能检测到IL-10血清水平的增加,与此同时能提高免疫接种后1周和2周内这些小鼠的抗体滴度。在免疫接种后的21d,小鼠脑内激发的活的VEE病毒水平将显著降低,这些结果表明MT可提高小鼠免疫接种的作用,从而对抗VEE病毒[27]。
5 结束语
病毒感染是当今普遍存在的问题,目前对病毒感染学说众说纷纭,尚未有明晰结论。近年对松果腺及MT研究的进展,使这项研究得到新的启示。MT对VEE病毒感染有免疫作用,它可以通过IL-1β而介导,在CNS感染疾病期间,白细胞介素是初期的宿主调节因子之一。这些研究表明,MT虽然不是抗微生物制剂,但是MT具有免疫调节作用,其作用可以用于抵抗VEE和其他病毒性疾病,包括SARS[28]。MT免疫调节作用、抗氧化作用和神经保护作用,使MT必将成为另一种与病毒类疾病作战的治疗选择。
参 考 文 献
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