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【摘 要】：目的：建立高效液相色谱法测定灵芝北芪片中腺苷的含量，以便更有效的控制其内在质量。方法：采用高效液相色谱法VP－ODS柱（150mm×4．6mm，5μm）；磷酸盐缓冲液（PH6．5）－甲醇（173），检测波长260nm，流速1．0ml・min－1，柱温为室温。结果：腺苷在3．93～39．28mg・L－1（r＝0．9999）范围内线性关系良好，平均回收率为99．5％，RSD＝0．89％。结论：本法简便，灵敏，重复性好，可用于灵芝北芪片中腺苷的含量测定。
【关键词】：灵芝北芪片高效液相色谱法腺苷含量测定
【中图分类号】R284．1；R944．4【文献标识码】A【文章编号】1007－8517（2008）08－0042－02
Determination of adenosine in Lingzhi Beiqi Pian by HPLC
Zhao Cheng
LuAn Institute for Drug Control ，LuAn 237000，China
AbstractAim To establish a method for the determination of adenosine in Lingzhi Beiqi Pian ．MethodsHPLC method was used ．The samples were separated by VP－ODS column（150mm×4．6mm，5μm） The mobile phase was phosphate acid buffer solutionPH6．5－ methanol173，The detection wavelength was 260nm ，Flow rate was 1．0 ml．min－1 ，The column temperature was Indoor temperature．ResultsThe linear range ofadenosine was3．93mg．L－1～39．28mg．L－1 r＝0．9999，n＝6．The average recovery was 99．5％， RSD＝0．89％． Conclusion This method is simple， sensitive ，accurate and can be used to determine the contents of adenosine in Lingzhi Beiqi Pian．
Key words Lingzhi Beiqi PianHPLC adenosine determination
灵芝北芪片是由灵芝膏粉、黄芪膏粉两味中药提取物组成，具有养心安神、补气益血的功效。用于神经衰弱，失眠健忘，食少体倦，气短多汗等症的治疗1。现行标准中尚无相关有效成分的定量指标。灵芝作为方中君药，决定了本方制剂的功效，腺苷是灵芝中的主要活性成分2，本文建立高效液相色谱法测定其中腺苷的含量，为有效控制其内在质量，进一步完善该制剂的质量标准提供了实验依据。
1 仪器和试药
1．1 仪器 日本岛津高效液相色谱仪LC－10ATVP、SPD－10AVP、CBM－102色谱工作站，VP－ODS色谱柱150mm×4．6mm，5μm，梅特勒－托利多AB135－S电子天平。
1．2 试药 腺苷对照品879－200202，供含量测定用，中国药品生物制品检定所；灵芝北芪片批号060227，060415，061012，070124，070517，市售产品；甲醇为色谱纯天津市四友生物医学技术有限公司；水为重蒸馏水；其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2．1 色谱条件 色谱柱为VP－ODS色谱柱150mm×4．6mm，5μm；流动相：磷酸盐缓冲液pH6．5取0．01mol／L磷酸二氢钠68．5ml与0．01mol／L磷酸氢二钠31．5ml，混合pH6．5―甲醇173；流速为1．0ml・min－1；检测波长为260nm；柱温为室温。理论板数按腺苷峰计算不低于2000。
2．2 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥12小时的腺苷对照品9．82mg，置50ml容量瓶中，用15％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为196．4mg・L－1。
2．3 供试品溶液的制备 取供试品，研细，精密称取1．0g，置25ml容量瓶中，加15％甲醇适量，超声处理30min取出放冷，加15％甲醇至刻度，用0．45μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2．4 阴性溶液的制备 按处方比例称取除灵芝膏粉外的其它药材，按灵芝北芪片的制备工艺及供试品的制备方法制备阴性溶液。
2．5 空白试验 取对照品、供试品溶液及阴性溶液按上述色谱条件各进样20μl，测定，结果表明阴性无干扰。
2．6 线性关系考察 取已配制好的浓度为196．4mg・L－1的腺苷对照品溶液，分别精密吸取1、2、3、4、6、8、10ml，置50ml量瓶中，用15％甲醇溶液稀释至刻度，得腺苷对照品系列标准浓度的溶液，按上述色谱条件，分别进样20μl，测定峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标、腺苷浓度X为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程：Y＝6467x＋982，r＝0．9999。结果表明腺苷在3．93～39．28mg・L－1之间有良好的线性关系。
2．7 精密度试验 精密吸取腺苷对照品溶液20μl，在同一实验条件下，重复进样5次，测定峰面积，RSD＝0．93％n＝5，仪器精密度良好。
2．8 加样回收率试验 取已知含量的供试品，平行6份，分别精密加入腺苷对照品适量，按供试品溶液的制备方法处理。测定腺苷含量，结果见表1，得平均加样回收率为99．5％，RSD＝0．89％，n＝6。
2．9 稳定性试验 精密吸取依法制备的同一供试品溶液，在24小时内每隔4小时重复进样，共7次，每次20μl，则在0，4，8，12，16，20，24小时时，测定其峰面积。结果其峰面积的相对标准偏差RSD＝0．96％n＝7，表明供试液中腺苷在24小时内稳定。
2．10 重复性试验 精密称取同一批号的样品批号：070517共5份，按含量测定项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件注入液相色谱仪，计算腺苷的含量分别为0．3125、0．3207、0．3151、0．3132、0．3177mg・g－1，平均值为：0．3158mg・g－1，RSD＝1．07％。
2．11 样品测定 取不同批号样品5份，按2、3项下方法制备样试液，依法测定，以外标法计算，结果见表2。
3 讨论
在实验中腺苷含量测定参照了《中国药典》2005年版一部“冬虫夏草”项下的有关规定。同时对供试品溶液的制备方法进行改进。比较了水、15％甲醇、50％甲醇及90％甲醇作为提取溶媒，结果采用15％甲醇作为提取溶媒效果最好。考察了超声处理10、20、30、40、60min，结果表明，30min后腺苷含量基本不再改变。
根据文献3、4、5，试用乙腈－水（6∶94）、0．1％酸酸胺―甲醇（90∶10）等作流动相，但结果总不理想，腺苷峰分离度不好，出现拖尾，而采用磷酸盐冲液（pH6．5）―甲醇（17∶3）流动相，达到基线分离，效果满意。
本方法简单可行、精确度高、重现性好，可作为控制该产品质量指标，有利于提高灵芝北芪片的质量水平。
参考文献
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3徐丽华，靳春荣，庄明蕊．HPLC法测定灵芝珍珠口服液中腺苷的含量J．中国药品标准，2003，4（2）：30．
4张勇、张云．HPLC法测定板蓝根配方颗粒中腺苷含量的研究J．安徽医药，2006，10（10）：753～754．
5邓意辉、刘丹、吴琼等．苦碟子注射液中腺苷的含量测定J．沈阳药科大学学报，2003，20（6）：43～6．
（收稿日期：2008．6．15）
