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【摘要】 目的 建立一种新的快速诊断巨细胞病毒(CMV)感染的方法并初步用于肾移植受者。方法 采用抗CMV抗原的单克隆抗体，运用免疫组化链菌素-生物素标记法对外周血白细胞核中CMV抗原(即刻早期抗原和早期抗原)进行染色，诊断CMV感染。结果 共检测肾移植受者72例，CMV活动性感染率为47%(34/72)，CMV病发病为18%(13/72)。CMV抗原阳性细胞数在CMV活动性感染者中平均为11.5/5万WBC，在CMV病者为20.5±17.8/5万WBC。同时检测10名健康人，结果均为阴性。结论 该法具有快速、简便、成本低等优点，且能达到定量检测的目的，可用于临床对CMV感染的早期快速诊断。
【关键词】巨细胞病毒抗原 肾移植 免疫组化链菌素-生物素标记
Clinical Application of Cytomegalovirus Antigen Monitoring in Renal Transplantation HONG Ji-bo. (Chengwu Couty People"s Hospital, Chengwu 274200,China)
【Abstract】Objective to establish a new method for the diagnosis of human cytomegalovirus(HCMV) infection and disease in renal transplant recipients.Methods labeled streptavidin biotin (LSAB)method with CMV monoclonal antibody was used to detect CMV antigen in peripher、al blood leukocytes.Results CMV antigen positive cells were counted in every 5.0×10�4 wbc. 72 renal transplant recipients wereinvestigated. The rate of CMV active infection was 47% (34/72) and the average count of CMV antigen positive cells was 11.5/5.0×10�4 WBC. The incidence of CMV disease was 18% (13/72) with a CMV antigen value of 20.5±17.8/5.0×10�4 WBC. 10 healthy people were also studied and the results of CMV antigen were negative.Conclusions This method provides a rapid, accurate and low cost approach to the diagnosis of CMV infection and can be quantified easily.
【Key words】Cytomegalovirus antigens;Kidney transplantation Labeled streptavidin biotin method
【中图分类号】R392.4
【文献标识码】A
【文章编号】1814-8824(2009)-02-0012-02
巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染在免疫功能正常的健康人极少出现临床症状，而在免疫功能低下或缺失的患者可能会发展成有严重临床症状的CMV病(或称CMV综合征)，威胁患者的生命。在肾移植受者中，由于免疫抑制剂的应用，CMV感染较为常见，约占50%或以上，其中10%～30%可发展成CMV病［1］，导致移植肾功能丧失或患者死亡。因此，对CMV感染进行早期、准确的诊断具有极其重要的意义。我们采用免疫组化链菌素-生物素标记(labeled streptavidin biotin，LSAB)法对外周血白细胞中CMV抗原进行染色从而诊断CMV感染，并将该方法初步应用于临床，达到了早期、快速诊断的目的，现介绍如下。
1 研究对象
检测1996年2月～1997年3月在本院接受肾移植的受者72例，其中男52例，女20例，年龄26～65岁，平均42.5岁。所有受者术后均用环孢素A＋强的松＋硫唑嘌呤(CSA＋pred＋Aza)三联免疫抑制方案。
2 设备及试剂
普通光学显微镜； CMV单克隆抗体；LSAB试剂盒(购自丹麦DAKO公司，批号为K9002)；Tris碱。
3 CMV抗原检测(LSAB法)
3.1 标本收集和处理 外周静脉血3～5 mL，EDTA抗凝，离心5min(500 r/min)，吸取血浆层移入另一离心管。离心8～10min(1 000 r/min)，弃去上清液，加0.83% nH4Cl数滴，冰水中作用5min，以溶解混杂的红细胞。加大量Tris-盐酸碱缓冲液(TBS)稀释，离心5min(600～800 r/min)，弃去上清液，加适量TBS，普通光学显微镜下调整细胞浓度(含WBC1.0×10�6/mL)。
3.2 细胞片制备 微量吸管吸取上述白细胞悬液50 μL(含WBC5万个)，加玻片上，面积约2 cm×2 cm大小，干燥后用4℃丙酮固定10min，每例标本涂片2张。
3.3 CMV抗原染色 细胞片置0.3%H2O2中10min(室温)，以阻断内源性过氧化物酶反应，TBS洗片。滴加1∶20倍稀释的正常猪血清阻断剂，阻断非特异性蛋白结合，37℃作用30min，TBS洗片；滴加1∶20倍用TBS稀释的抗CMV即刻早期蛋白和早期蛋白的单克隆抗体(一抗)，37℃孵育30min，TBS洗片。加1∶400倍稀释的连接剂(二抗，为兔抗鼠IgG)，37℃30min，TBS洗片；加1∶400倍稀释的链菌素(streptavidin)，37℃30min，TBS洗片。滴加新配制的3，3二氨基联苯胺(DAB)溶液(含TBS 5 mL+DAB5 mg+3% H2O2 15 μL)显色1～3min或光学显微镜下控制显色；苏木素液淡染1～2min，清水洗片。25倍物镜观察整张细胞片，计数阳性细胞个数。
4 讨论
目前诊断CMV感染常用方法有抗体检查、病毒培养、聚合酶链反应(PCR)、病毒核酸杂交
等，但都存在不足，难以满足临床需要。如抗体检查，由于用免疫抑制剂后，部分患者可无抗体反应或反应延迟而影响阳性率；病毒培养法繁琐，费时长(1周以上)，并且易受细菌、霉菌等生长所污染，目前已很少应用；病毒核酸杂交技术难度较大且复杂，难以普及应用；而PCR检查也易受多因素影响，并且由于敏感度高可能检测出隐性感染者或出现假阳性。此外，上述方法均不能做到定量检测。基于上述因素，参照国外的实验［2］并作适当的改进(用LSAB法代替ABC法)，我们对外周血白细胞中CMV抗原进行检测(LSAB法)，避免了上述方法的不足，对CMV感染能做出快速的诊断。
CMV感染细胞后可在细胞核内表达即刻早期、早期和晚期蛋白(即病毒抗原)。即刻早期蛋白属磷酸蛋白，分子量为65 000，通常在病毒感染细胞后3～4h即开始合成，并在以后的病毒基因表达中起着重要的作用；早期蛋白在其后稍晚合成。二者均属病毒复制调控蛋白，其存在提示病毒呈活动状态。CMV抗原测定即是利用针对即刻早期蛋白的单克隆抗体，运用免疫组化染色的方法对感染细胞核进行染色，可以直接反映外周血中有无活动性CMV感染。而隐性感染者CMV潜伏无复制，故无病毒蛋白表达，抗原染色为阴性。本研究对10名健康人检查结果均为阴性。CMV抗原最早在感染后数小时即可检测出来，可用于早期诊断。
CMV抗原检测方法需时较短，一般仅需5～6h，无需昂贵设备，在普通实验室即可开展，且成本较低，不失为一种快速、简便、准确而敏感性高的诊断CMV感染的方法，目前国内尚未开展，值得推广应用。
参考文献
1 Metselaar hJ, Weimar W. Cytomegalovirus infection and renal transplantation［J］. Antimicrobchemother, 1989,23:37-47.
2 Van der Bij W, Torensma R, van Son WJ,et al.Rapid immuno-diagnosis of active cytomegalovirusinfection by monoclonal antibody staining of blood leucocytes［J］. med Virol,1988,25:179-188.
