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[摘要] 目的 分析浙江省萧山区婴幼儿急性腹泻患者中分离的轮状病毒A组G型、P型的基因序列,探讨该病毒的遗传变异和分子特性。方法收集2010年6～12月浙江省萧山区急性婴幼儿(≤5岁)腹泻患者粪便标本，应用多重PCR技术从临床标本中扩增轮状病毒A组G型、P型基因片段并测序分析，比较基因的亲缘关系并绘制进化树。结果 162例粪便样本，ELISA结果为54例阳性。PCR检测结果 G1型为32株，G2为5株，G3为9株，P型中，P4为3株，P8为5株，成功地对16例A组轮状病毒基因进行测序。2010年A组轮状病毒基因的核苷酸序列与参考株具有较高的同源性，且A组基因核苷酸序列发生了一定的变异。结论 轮状病毒A 是引起浙江萧山地区急性腹泻的主要的病原之一，其病原具有基因型别的多样性，G1型可能是2010年浙江萧山地区流行的优势株。
[关键词] 轮状病毒；同源性；进化分析
[中图分类号] R373.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）25-17-03
Analysis of Homology and Evolution of G and P Genotype of Rotavirus A Group in Xiaoshan of Zhejiang Province
ZHANG QunweiKONG JiangyingSHEN Limeng
Department of Clinical Lab, Xiaoshan Hospital in Zhejiang Province, Hangzhou 311201, China
[Abstract] Objective To analyze the gene sequence of rotavirus A group of G and P genotype from acute diarrhea patients in Xiaoshan district of Zhejiang Province and explore the virus genetic variation and molecular characteristics. MethodsCollect stool specimens of infants（≤5 years）with acute diarrhea in Xiaoshan district of Zhejiang Province from Jun 2010 to Dec 2010, and G and P genes of rotavirus A group from clinical specimens were amplified by multiplex RT-PCR, the amplified products with expected size were submitted to direct sequencing. Genetic factors were analyzed and drawn phylogenetic trees. Results Fifty-four cases of rotavirus A group gene were amplified from 162 cases of stool samples. 47 cases were G type, and 7 cases were P type. 32 strains were G1 type, 5 strains were G2 type, 9 strains were G3 type; 3 strains were P4 type, 5 strains were P8 type. 16 products with positive samples were successfully sequenced. After alignment, high homologies of amino acids of G and P genes were observed among sequences of rotavirus A group virus. However, some mutations of rotavirus A group were found in 2010. ConclusionRotavirus A viruses were one of the major pathogens causing acute diarrhea of infants （≤5 years）, multiple genotypes of Rotavirus A were found in the specimens, and G1 genotype was probably identified as the prevalent strain in Xiaoshan, Zhejiang province in 2010．
[Key words] Rotavirus; Homology; Evolution
轮状病毒（Human Rotavirus ,HRV）是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科。它是婴幼儿腹泻的单一主因，几乎世界上每个大约5岁的儿童都曾感染过轮状病毒至少1次。轮状病毒总共有7种，以英文字母编号为A、B、C、D、E、F与G。其中，A种是最为常见的一种。轮状病毒由6种病毒蛋白质（viral protein，VP）架构了整个病毒颗粒（病毒体）。这些“结构性”的蛋白质分别被称为VP1、VP2、VP3、VP4、VP6与VP7。VP7和VP4组成HRV的外部衣壳，二者都是中和抗原，可诱导机体产生中和抗体。目前根据HRV的主要外壳蛋白VP7和VP4中和抗原性的差异，A组HRV至少有16个G血清型和28个P基因型[1]。全球不同地区流行病学调查表明，G1、G2、G3、G4和G9是人类感染HRV最常见的流行优势株[2]，而P型最常见的优势株为P8和P4型[3]。本文分析了2010年6～12月浙江省萧山区A组G型、P型轮状病毒的发展趋势。为婴幼儿腹泻的监测和防控提供重要依据，并为进一步进行分子生物学研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1样本来源
收集2010年6～ 12月浙江省萧山医院162例婴幼儿（≤5岁）急性腹泻就诊患者的粪便标本。
1.2主要仪器和试剂
仪器：A组轮状病毒ELISA 检测试剂盒（DAKO）；S1000TM Thermal Cycler。试剂：Viral Nucleic Acid Extraction KitⅡ（Geneaid）；一步法RT-PCR试剂盒Takara One Step RNA PCR Kit（AMV）；DNA Marker DL2000、琼脂糖均购自TaKaRa公司；普通梯度PCR仪Bio-Rad等。
1.3引物
利用DNAMAN 5.1.0.0软件分析轮状病毒不同毒株A组VP7基因和VP4基因的相对保守区域设计引物，并进行BLAST序列比对初步验证引物特异性。G血清型PCR分型引物见表1，P基因型PCR分型引物见表2。
表1A组轮状病毒G分型引物序列
引物G分型 位置 序列（5’---3’) 产物（bp）
Beg9 G(+) 1-28GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG
End9G(-) 1062-1036GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG 1062
aAT8G8(+)178-198 GTCACACCATTTGTAAATTCG 885
aBT1G1(+)314-335 CAAGTACTCAAATCAATGATGG 749
aCT2G2(+)411-435 CAATGATATTAACACCTTTTCTGTG 652
aDT4G4(+)480-498 CGTTTCTGGTGAGGAGTTG 583
aET3G3(+)689-709 CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG 374
aFT9G9(+)757-776 CTAGATGTAACTACAACTAC 306
表2A组轮状病毒P分型引物序列
引物G分型位置 序列（5’---3’) 产物（bp）
4Con3 P(+)11-32 TGGCTTCGCCATTTTATAGACA
4Con2 P(-) 868-887ATTTCGGACCATTTATAACC 876
1T1 P[8]（-） 339-356 TCTACTTGGATAACGTGC 345
2T1 P[4]（-） 474-494 CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC 483
3T1 P[6]（-） 259-278 TGTTGATTAGTTGGATTCAA 267
4T1 P[9]（-） 385-402 TGAGACATGCAATTGGAC 391
5T1 P[10]（-） 575-594 ATCATAGTTAGTAGTCGG 594
1.4ELISA检测轮状病毒
严格按照人A组轮状病毒ELISA检测试剂盒说明书进行操作，检测粪便中的A组轮状病毒。
1.5核酸的提取和PCR扩增基因
1.5.1核酸的提取 采用PBS溶液将粪便标本制备成10%的粪便悬液，离心后取200μL上清，根据Viral Nucleic Acid Extraction Kit Ⅱ（Geneaid）的操作说明书提取轮状病毒的核酸RNA，核酸样品的最终洗脱体积为50μL，分装并保存于-70°C备用。
1.5.2G型PCR分型 一次扩增反应体系：Beg9（20μmol/L） 1μL，End9（20μmol/L） 1μL，病毒RNA 5μL，DEPC处理H2O 3μL，98℃变性5min，迅速置于冰内冷却。在上述溶液中加入以下反应液：10×ExTaq Buffer5μL，dNTP（各10mmol/L） 1.6μL，ExTaq酶 0.25μL，AMV反转录酶（10U/μL） 0.2μL，DEPC处理H2O 32.95μL。
反应条件：42℃ 30min；94℃ 5min；30个循环（94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 1min）；72℃终延伸7min。
二次扩增反应体系：总反应体积25μL ，10× ExTaq Buffer 2.5μL，dNTP（各10mol/L） 0.8μL，ExTaq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.125μL，AT8（20μmol/L） 0.5μL，aBT1（20μmol/L）0.5μL，aCT2（20μmol/L） 0.5μL，aDT4（20μmol/L） 0.5μL，aET3（20μmol/L） 0.5μL，aFT9（20μmol/L） 0.5μL，End9（20μmol/L） 0.5μL，一次产物1μL，加H2O至25μL。
反应条件：94℃ 1min；30个循环（94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 1min）；72℃ 7min。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,根据DNA分子量标准判断扩增条带大小。
1.5.3 P型PCR分型 一次扩增反应体系：4Con2（20μmol/L）1μL，4Con3（20μmol/L） 1μL，病毒RNA 5μL，DEPC处理H2O 3μL，98℃变性5min，迅速置于冰内冷却。在上述溶液中加入以下反应液：10×ExTaq Buffer2.5μL，dNTP（各10mmol/L） 1.6μL，ExTaq酶 0.25μL，AMV反转录酶（10U/μL） 0.2μL，DEPC处理H2O 32.95μL。
反应条件： 42℃ 30min；94℃ 5min，30个循环（94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 1min），72℃ 7min。
二次扩增反应体系：总反应体积25μL，10× ExTaq Buffer 2.5μL，dNTP（各10mol/L） 0.8μL，ExTaq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.125μL，1T1（20μmol/L） 0.5μL，2T1（20μmol/L） 0.5μL，3T1（20μmol/L） 0.5μL，4T1（20μmol/L） 0.5μL，5T1（20μmol/L） 0.5μL，4Con3（20μmol/L） 0.5μL，一次产物 1μL，加H2O至 25μL。
反应条件：94℃ 1min；30个循环（94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 1min）；72℃ 7min。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,根据DNA分子量标准判断扩增条带大小。
1.6基因序列测定和进化树分析
将PCR产物委托上海生工生物技术有限公司对基因序列进行双向测定。测序结果将引物序列去除后，应用DNAMAN（5.1.0.0）与Sequencher4.7软件进行序列的拼接、比对和分析，利用MEGA4.0软件（http://www.省略/）与DNAstar 5.1对A组轮状病毒VP7和VP4基因核苷酸序列进行同源性分析并绘制系统进化树。所用参考毒株序列来源于GenBank。
2结果
2.1轮状病毒A组基因的RT-PCR扩增结果
急性腹泻患者的粪便样本通过ELISA方法检测，162例婴幼儿患者腹泻粪便标本中A组RV阳性54例，阳性率33.3%（54/162）。利用特异性引物对其进行RT-PCR扩增，扩增产物的电泳结果如图1所示，此次扩增出G1、G2、G3、P4及P8型，目的条带的大小与预期相符，其中G型最常见的是G1型，为32株，G2为5株，G3为9株，P型中，P4为3株，P8为5株。
图1 A组轮状病毒基因扩增结果：1.DL2000;2.G1型;3.G2型;4-5.G3型;6.G型阴性对照;7.P4型;8.P8型;9.P型阴性对照
2.2RT-PCR扩增产物的测序及序列拼接结果
选取G1型6株、G2型3株、G3型4株、P4型2株和P8型1株送上海生工生物技术有限公司对基因序列进行双向测定，应用DNAMAN（5.1.0.0）与Sequencher4.7软件进行序列的拼接、比对和分析。
2.3A组轮状病毒基因核苷酸的同源性比较与进化树分析
根据已报道的A组轮状病毒基因核苷酸序列与2010年中部分A组轮状病毒基因核苷酸的序列，利用MEGA4.0软件与DNAstar 5.1对A组基因核苷酸序列进行同源性分析并绘制系统进化树。
2.3.1A组轮状病毒基因核苷酸的同源性比较和进化分析
2.3.1.1G型同源性比较和进化分析 通过对所测基因的核苷酸进行同源性比较和进化分析表明,13株G型轮状病毒中G1型6株、G2型3株、G3型4株。其中G1型（46-RVA、51-RVA、50-RVA、17-RVA、85-RVA和34-RVA）基因核苷酸与GU377206.1、GU377196.1、AB534521.1、GU985236.1和GU985240.1的基因核苷酸序列同源性为94.6%～99.2%；G2型（65-RVA、79-RVA和69-RVA）基因核苷酸与HM066079.1、HM066080.1、HM467956.1的基因核苷酸序列同源性为92.7%～98.5%；G3型（162-RVA、87-RVA、24-RVA和91-RVA)基因核苷酸与HM773741.1、GU985255.1、AB525801.1、DQ873676.1的基因核苷酸序列同源性为95.8%~99.2%，见图2。
2.3.1.2P型同源性比较和进化分析 通过同源性和进化分析的3株轮状病毒P型中P4型2株、P8型1株。其中P4型（77-RVA-P和69-RVA-P）基因核苷酸与FJ623232.1、T76253.1、R88129.1、D61165.1、HM467941.1的基因核苷酸序列同源性为92.7%~99.4%；P8型（75-RVA-P）基因核苷酸与GU563717.1、HM773736.1、HQ230040.1、HQ230043.1、HQ230043.1的基因核苷酸序列同源性为93.9%~96.8%，见图3。
图2G型A组轮状病毒基因核苷酸进化树
3讨论
轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体，是引起婴幼儿腹泻的主要致病因子[4]，全世界每年约有60万5岁以下儿童的死亡与RV有关。其中A组轮状病毒是引起婴幼儿非细菌性腹泻的主要病原，根据全球不同地区流行病学调查，G1、G2、G3、G4和G9是人类感染HRV最常见的流行优势株。而目前在世界范围内常见的 P 基因型主要是 P8和 P4，我们所检测出的P型A组轮状病毒中,其流行株也主要是 P8和 P4 ,与国内其他地区报道一致。20世纪70～80年代的有关资料显示，在世界各地RV的检测阳性率为11％～70％，国内一些资料显示，RV的一年阳性检出率约40％～60％[5]。
本次研究的标本均为≤5岁的婴幼儿，ELISA方法检测RV阳性率为33.3%（54/162），PCR扩增出G1、G2、G3、P4及P8型，目的条带的大小与预期相符，其中G型最常见的是G1型为32株，G2为5株，G3为9株，P型中，P4为3株，P8为5株。可见萧山地区的A组轮状病毒以G1为主，其次为G3、G2、P8、P4 型，结果与我国其他地区，如重庆和上海地区报道一致[1，6]；而长春和河北省卢龙等地区的检测结果中A组轮状病毒以G3为主，其次为G1[7，8]。
另外，G9型自从1994年在北京地区被发现以来，相继在我国其他地区被发现，如河北省卢龙，天津等地区，且呈现越来越多的趋势[8，9]。本次研究当中未检测出G9型，构建系统进化树的13株标本核酸序列也与G9型参考株相比同源性很差，说明该型尚未在萧山地区引起流行，但不能忽略此型的增长趋势。
近几年来，国际上A组轮状病毒的分布在不同地区每年都会有变化。在一些亚洲国家，G1型流行优势株存在被G3型和G9型取代的趋势；如越南在2006 ～2007年的调查研究中显示以G3型为主的流行优势株[10]。在泰国的1993 ～2007年的长期综合调查中，在总的结果中G1型为第一位，其次为G9 型；按年份分析，1993 ～1999年以G1型为主、2000 ～2003年以G9型为主、2003 ～2004年和2006 ～2007年又以G1型为主[10，11]。P型则仍以P8为流行优势株，P6型虽在全球范围内并不常见，但是近期研究表明P6型在我国云南、卢龙等地区也越来越常见[12，13]。针对A组轮状病毒快速而多样的变化趋势，及时跟踪调查和研究，对疾病的防治和疫苗的生产具有极大的意义。
本实验室2010年6～12月对A组轮状病毒的监测表明，萧山地区的HRV感染G1亚型变异株是流行优势株；P型则以P8、P4亚型变异株为主。由HRV引起的急性腹泻患者中各个G、P亚型具有基因型别多样性，这种特点可能增加了感染的概率和波及范围。这些发现对我国病毒性腹泻的预防和治疗具有重要意义，对轮状病毒疫苗的研究也有重要的价值。
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（收稿日期：2011-07-22）
