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[摘要] 目的 了解抗原修复对免疫组化染色结果的影响，分析抗原修复后免疫组化染色P53蛋白和CA-125阳性率的关系。方法 卵巢癌标本93例，其中浆液性腺癌47例，黏液性腺癌39例。子宫内膜样癌5例，未分化癌2例，采用高温高压法进行抗原修复，免疫组化Envision法染色检测P53蛋白和CA-125的表达。结果 抗原修复后切片背景干净，显色对比鲜明，结构清晰，定位准确，易于观察，P53蛋白阳性率（66.7% 比 48.4%）和CA-125阳性率（58.1%比40.0%）均高于未修复组，有显著性差异（P＜0.05）。结论 抗原修复技术对提高卵巢癌免疫组化染色质量有一定提高。
[关键词] 卵巢癌；免疫组织化学；抗原修复；病理诊断
[中图分类号]R737.31 [文献标识码] B [文章编号]1673-9701（2011）19-93-02
卵巢肿瘤是女性生殖器常见肿瘤，卵巢癌病死率居妇科恶性肿瘤之首。随着免疫组化技术在肿瘤病理诊断中的不断深入和广泛应用， 卵巢肿瘤特异性抗原或者基因的检测日趋成熟，对卵巢肿瘤的病理分型和预后的判断越来越有意义[1，2]。但是由于组织定会引起蛋白内和蛋白间的亚甲基桥的桥连，引起许多抗原决定簇被封闭，影响了免疫组化的结果。本研究通过高温高压处理法进行抗原修复、免疫组化技术检测卵巢上皮肿瘤组织中P53蛋白、CA-125，现报道如下。
1资料与方法
1.1 标本来源
卵巢癌标本93例，均来自我院2006年1月～2010年12月住院的卵巢肿瘤患者，年龄18～74岁，平均52.3岁。术前无放疗及化疗史，经术后病理证实为上皮性卵巢癌。其中浆液性腺癌47例，黏液性腺癌39例。子宫内膜样癌5例，未分化癌2例。
1.2组织来源
所有组织来源于我院病理科，经术后病理证实为卵巢上皮性恶性肿瘤。标本固定于中性福尔马林中，4 ℃下24h常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片。切片厚4μm。每例均切6张，附贴于涂有多聚-L-赖氨酸的玻片上，置60℃烤箱内烘烤。将每个病例的6张切片随机分为两组，组1为不修复组，组2为抗原修复组。
1.3抗原修复方法
组1不进行抗原修复，直接进行免疫组化染色；组2采用高温高压法进行抗原修复，市售家用压力锅，工作压力为90 kPa。石蜡切片脱蜡至水。PBS浸泡3次，每次2min。将修复液0.01mmol柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）烧开后将切片放入高压锅中，然后盖好盖子，加上气压阀，继续加热至喷汽时，即达到工作温度和工作压力，开始计时2min后压力锅离开热源，自然冷却。
1.4免疫组化染色
免疫组化Envision法染色检测P53蛋白和CA-125的表达。所使用试剂P53蛋白单克隆抗体、CA-125及Envision试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，按其使用说明书操作。用已知P53阳性的鼻咽癌切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。组1石蜡切片脱蜡至水。组2切片自然冷却后，3%H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗2次，PBS浸泡3次，每次2 min；滴加一抗工作液，37 ℃孵育2 h或4 ℃过夜；PBS冲洗3次，每次2 min；滴加适当量的二抗，37 ℃孵育 0.5 h；PBS冲洗3次，每次2 min；DAB显色；自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
1.5阳性结果
判断标准P53蛋白阳性细胞核内有棕色颗粒状物质、CA-125阳性细胞膜染成棕黄色为阳性。根据阳性细胞所占比例分为4级：0％为阴性（-），1%～10％为弱阳性（+），11%～50％为中等阳性（++），＞50%为强阳性（+++）。
1.6统计学处理
两组率的比较采用卡方检验，以P＜0.05为有统计学意义。
2结果
抗原修复后切片背景干净,显色对比鲜明，结构清晰，定位准确，易于观察；P53蛋白阳性率和CA-125阳性率均高于未修复组，详见表1。
3 讨论
免疫组化是免疫组织化学技术的简称，它是应用抗原、抗体特异性结合的原理，使用已知的抗体在病理切片上与相应的抗原结合，然后把结合产物应用组织化学的方法显现出来，使之可以在显微镜下观察得以确认；是免疫学与分子生物学技术和病理形态结合的一门新兴学科，具有操作简单、敏感性高、特异性强及将形态、代谢和机能密切结合起来等优点，已广泛用于病理诊断、鉴别诊断[3]。但经10%中性福尔马林固定石蜡包埋的切片，组织中的许多抗原决定簇被醛基交联封闭，以至于无法与抗体结合，从而影响染色结果。并且固定时间越长的标本，它所形成的交联就越紧密，抗原就越难以被激活，所需的修复强度也就越强。因此组织中抗原性修复技术与免疫组织化学染色的成败有十分密切的关系[4]。CA-125和P53是常用的卵巢肿瘤标志物，与肿瘤大小、病理类型、分化程度、病人的预后、术后易复发等指标密切相关[5]，因此准确进行免疫组化染色检查对临床工作意义重大。本文应用高温高压法对93例卵巢癌组织切片分别进行抗原修复，发现修复后切片背景干净,显色对比鲜明，结构清晰，定位准确，易于观察，方法稳定，结果可靠，可提高病理诊断的准确性。
1991年 “甲醛对蛋白的改建可以在高温120℃及酸碱作用下复原”，这一重要线索成功地创造了抗原修复技术，该技术被誉为“免疫组化染色的一次革命”，迅速在世界范围内推广。抗原热修复的原因和理论基础是通过加热水解被醛基交联封闭的许多抗原决定簇，使抗原决定簇被激活，其中修复的温度和时间非常重要。高压锅进行高温高压修复可以避免外界环境改变所致温度的影响，高压修复温度均一，节省时间。高压抗原修复法在染色强度和重复性等方面优于微波法[6]，是细胞核阳性的抗体。P53蛋白在细胞核表达，本文显示高温高压修复后P53在卵巢癌细胞核的表达水平提高，同时主要在细胞膜表达的CA-125的阳性率也提高了。因此针对卵巢癌P53和CA-125免疫组化染色，高压锅修复可以提高阳性表达率，染色清晰，操作简单，结果易于判断。
有报道用柠檬酸缓冲液（pH6.0）、EDTA缓冲液（pH9.0）及高压加热法,胰蛋白酶消化对CD68、lysozyme、α-AT和S-100不同的抗体进行修复，结果3种抗原修复法的免疫组化切片,胰蛋白酶修复法阳性率显著高于高压加热法与微波加热法且染色背景清晰,高压加热法与微波加热法非特异性着色较深,阳性率低[7]。抗原修复虽然可以提高免疫组化阳性率，但是修复的方法较多，包括酶修复、热修复等，不同组织类型、不同固定方法对抗原的修复应答亦有所差异，因此对不同的抗体建议选用不同的修复方法可提高表达率，提高病理诊断的准确性。
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（收稿日期：2011-02-25）
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