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［摘要］ 目的 通过分析超声背向散射积分(IBS)参数的变化评价苯那普利对自发性高血压大鼠(SHR)左室心肌纤维化的影响。方法 14只雄性SHR随机分成模型对照组(SHR组，n=7)和药物干预组(SB组,�n=7),另外选择7只雄性Wistar京都大鼠(WKY)作为正常对照组(WKY组)。SB组给予苯那普利灌胃(10 mg•kg-1•d-1)，WKY及SHR组给予等量蒸馏水灌胃。每周秤体质量，调节用药量。12周后超声测量左室射血分数（LVEF）、IBS参数(包括IBS%和CVIB)；对心肌组织进行Masson染色、嗜银染色及结缔组织生长因子(CTGF)免疫组织化学染色。结果 3组间比较IBS%值SHR组>SB组(PWKY组(PSB组>WKY组(均P (Modern Meical Journal,2008,36:245-249)
超声背向散射积分(integrated backscatter，IBS)是一种重要的组织定征技术，是利用影像学手段无创而有效地评价心肌组织特征的诊断方法之一。此前研究表明，IBS能反映心肌组织的胶原含量［1］。而高血压病心肌纤维化正是由于心肌组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原组织过度沉积造成的。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是近年发现的与纤维化密切相关的细胞因子［2］。本研究用声学密度-背向散射积分(AD-IBS)技术检测心肌的IBS参数，结合免疫组织化学的方法检测CTGF的表达、Masson染色反映的胶原及血管情况、嗜银染色观察到的嗜银纤维变化,探讨苯那普利对自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rat，SHR)心肌纤维化的抑制作用及可能机制。�
1 材料与方法�
1.1 动物分组及给药方法�
14只7周龄雄性SHR和7只雄性Wister京都大鼠(WKY)(均购自上海高血压研究所)，体质量120～150 g。适应性喂养1周后，抽签法将SHR随机分成模型对照组(SHR组，n=7)和药物干预组(SB组,n=7)；7只WKY大鼠作为正常血压对照组(WKY组)。SB组给予苯那普利(溶于蒸馏水中)灌胃(10 mg•kg-1•d-1)，WKY及SHR组给予等量蒸馏水灌胃，持续12周。�
1.2 试剂与仪器�
苯那普利(北京诺华制药有限公司)，兔抗CTGF多克隆抗体(abcom公司，UK)；即用型第二代免疫组化Elivision TM plus广谱试剂盒、DAB显色试剂盒、Masson三色染色试剂盒及嗜银染色试剂盒(福州迈新生物技术公司);SONOS 5500超声诊断仪(HP公司)；图像采集系统(Olympus公司)；Motic Med数码医学图像分析系统(深圳麦克奥迪实业有限公司)。�
1.3 超声检查�
大鼠经腹腔注射10%水合氯醛(350 mg•kg-1)麻醉后，取左侧卧位。应用HP SONOS 5500超声诊断仪，S8探头，经胸壁作心前区探测。测定常规心功能(左室射血分数，LVEF)后，启动声学密度(AD)定量系统，获得满意的左室长轴及乳头肌水平左室短轴切面，将连续2.48 s内62帧图像存入磁光盘。脱机后，将感兴趣区(ROI，11×11像素点)置于左室后壁中间段的心肌层及心腔内，随心动周期运动。分别得到心肌声学密度参数：平均图像强度(AII，即IBS)；峰峰强度(PPI,也即背向散射积分周期变化值，CVIB)；图像背向散射的标准差(SDI)。计算心肌校正IBS(IBS%)，IBS%=心肌层的IBS值/心腔IBS值。�
1.4 标本采集�
超声检查完毕后行腹主动脉放血处死动物，取出心脏，置入10%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片厚度4～5 μm，用于组织形态学观察(Masson染色、嗜银染色及免疫组织化学染色)。�
1.5 胶原纤维染色�
应用Masson三色法进行胶原染色，心肌细胞呈红色，胶原呈蓝色。Foot法嗜银染色显示嗜银纤维呈黑色或黑褐色，心肌细胞呈红色。应用Motic Med数码医学图像分析系统测量心肌胶原容积分数(CVF)、血管周围胶原面积(PVCA)及冠脉小动脉管壁厚/管外径值(T/D)。计算方法：CVF＝胶原面积/总面积，其中胶原面积不包括血管周围胶原面积(与嗜银纤维容积分数APFVF测量相同);PVCA＝壁内小动脉管腔周围胶原面积/该小动脉管腔面积。每项染色各组取14张切片，每张切片随机取5～10个视野，取其平均值。�
1.6 CTGF的蛋白表达�
应用免疫组织化学染色法测定。将涂有防脱剂(APES)的石蜡切片常规脱蜡至水，柠檬酸高压抗原修复。3％过氧化氢孵育10 min，滴加第一抗体CTGF工作液，浓度1∶600，4 ℃过夜。滴加聚合物增强剂作用20 min、酶标抗兔/鼠聚合物作用30 min，再加显色剂(DAB)显色3～5 min，复染，分化，脱水和封片。阳性反应为棕黄色颗粒状物质沉积。应用PBS替代第一抗体的方法作为阴性对照。采用医学图像分析系统，每组取14张切片，每张切片按顺序选12～20个200倍显微镜视野图像，测定阳性细胞的平均积分光密度，取其平均值。�
1.7 统计学处理�
全部数据均以Excel建库，通过SPSS 13.0软件包进行统计学分析。所有数据均以�x-±s�表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用非配对t检验,相关性用Pearson线性相关分析,P＜0.05为差异有统计学意义。
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2 结果�
2.1 超声指标的变化�
常规超声心动图检测结果显示，WKY组和SB组的LVEF值均在正常范围，SHR组与其他两组比较增高显著(P＜0.01)。左室后壁中部心肌的IBS%值SHR组>SB组(P＜0.01)>WKY组(P＜0.05)；CVIB水平SHR组SB组>WKY组(均P CTGF是近年发现的一种致纤维化细胞因子，广泛存在于人类多种组织器官，如心、肺、肾和结缔组织中，其异常表达与多种类型纤维化疾病进展密切相关。心肌组织中CTGF主要由心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和浸润的炎症细胞分泌［4］。生理情况下，CTGF基础量表达。本研究结果显示，与健康WKY组相比，SHR组CTGF的表达明显增高，苯那普利干预后CTGF的表达明显下降，纤维化程度也同时减轻，说明高血压的心肌纤维化可能与CTGF的高表达有关。苯那普利可以通过减轻CTGF的高表达改善心肌纤维化。目前有学者将CTGF列入器官纤维化的主要指标之一［5］。CTGF可能是治疗纤维化疾病更为有效和安全的新靶标。�
综上所述，SHR有明显的心肌纤维化，心肌组织CTGF高表达，苯那普利可能通过降低CTGF的高表达减轻心肌纤维化，并改善左室收缩功能。IBS技术可以准确反映大鼠心肌组织纤维化变化，可用于评价心肌纤维化程度及药物疗效，有望成为临床上评价纤维化的重要方法。�
［参考文献］�
［1］李华，万征，黄灿亮.超声背向散射技术的基础研究与临床应用［J］.中国医学影像学杂志,2004,12(3):218-220.�
［2］吴芳,杨方.结缔组织生长因子与心肌纤维化［J］.心脏杂志,2006,18(6):715-717.�
［3］董志恒，李才，曲萌.糖尿病大鼠心肌CTGFmRNA的表达及苯那普利的调节作用［J］.中国病理生理杂志，2004，20(8):1501-1503.�
［4］Finckenberg P,Merasto S,Louhelainen M,et al.Magnesium supplementation prevents angiotensin Ⅱ-induced myocardial damage and CTGF overexpression［J］.J Hypertension,2005,32(2):290-300.�
［5］Rueperez M,Lorenzo O,Blanco-Colio L M,et al.Connective tissue growth factor is a mediator of angiotensin Ⅱ-induced fibrosis［J］. Circulation, 2003, 108(12): 1499-1505.�
［收稿日期］2008-02-21
