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【摘要】目的：研究膈下逐瘀汤对肝癌Bel-7402细胞和大鼠肝癌组织中PTEN编码蛋白表达的影响，试图进一步阐明膈下逐瘀汤抗肝癌的可能机制。方法：体外实验：采用蛋白印迹试验(Western blotting analysis，WB)检测Bel-7402细胞不同时间PTEN蛋白的表达水平，各治疗组对PTEN蛋白表达水平的影响。体内实验：采用Western blotting analysis检测正常对照组、肝癌模型组、顺铂组、膈下逐瘀汤组、联合治疗组肝癌组织中PTEN蛋白的表达水平。结果：膈下逐瘀汤组作用Bel-7402细胞3 h时PTEN蛋白达到最高水平；与正常对照组、顺铂组、联合治疗组相比，膈下逐瘀汤组药物作用肝癌Bel-7402细胞3h后PTEN蛋白的表达均有明显差异，而联合治疗组治疗作用较膈下逐瘀汤组更为明显。与正常对照组相比，肝癌模型组、顺铂治疗组、膈下逐瘀汤组和联合治疗组PTEN蛋白表达均增高，顺铂治疗组较膈下逐瘀汤组有明显增高PTEN蛋白表达的作用，联合治疗组作用最显著。结论：PTEN蛋白水平的增高可能是膈下逐瘀汤抗肝癌的主要作用机制之一，膈下逐瘀汤与抗肿瘤药顺铂有协同作用。
【关键词】膈下逐瘀汤；肝癌；防治；研究
文章编号：1009-5519（2008）12-1742-03 中图分类号：R273 文献标识码：A
近年研究表明，肝癌的发生与多种癌基因及抑癌基因的表达异常有关。PTEN基因（phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10，第十号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因）是迄今发现的惟一一个具有酪氨酸、磷酸丝氨酸/苏氨酸双特异性磷酸酶活性的新型抑癌基因。该基因结构和功能等的异常广泛存在于人类多种恶性肿瘤中，是继p53后又一有重要意义的抑癌基因[1]。所以本研究从体外和体内实验两方面探讨膈下逐瘀汤对肝癌Bel-7402细胞和大鼠肝癌组织中PTEN蛋白表达的影响。
1 材料与制备
1.1 材料与试剂：RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；顺铂购自连云港豪森制药有限公司。磷酸化Akt 多克隆抗体购自美国cell signaling technology公司，辣根酶标记羊抗兔IgG、β-actin及化学发光试剂购自北京中山公司，肝癌Bel-7402细胞株、腹水型Walker-256肿瘤细胞株购自于上海细胞库，所有中药均购自南方医院中药房，wistar雄性大鼠购自南方医科大学实验动物中心。
1.2 药物的制备：膈下逐瘀汤按《医林改错》方组成：五灵脂6 g，当归9 g，川芎6 g，桃仁9 g，丹皮6 g，赤芍6 g，乌药6 g，延胡索3 g，甘草9 g，香附5 g，红花9 g，枳壳5 g，在中医药学院实验室研粉、煮沸、离心、过滤，配成浓度为0.740 g/ml的药液，顺铂配成0.300 mg/ml的药液，4 ℃冰箱保存备用。
2 实验方法
2.1 体外实验
2.1.1 细胞株及培养条件：Bel-7402细胞体外培养于10%胎牛血清RPMI-1640培养基中，细胞长满单层后，胰酶消化，传代培养。所有实验用的细胞均处于对数生长期。实验各组血清浓度均为10%。
2.1.2 实验分组：（1）正常对照组；（2）肝癌模型组；（3）膈下逐瘀汤组；（4）顺铂组；（5）联合治疗组[（2）+（3）]。
2.1.3 含药血清的制备：20只wistar雄性大鼠，体重200~230 g，清洁级。正常对照组给予相应剂量的生理盐水，其余各组每日按1 ml/100 g经胃灌膈下逐瘀汤1次，连续7天。腹腔麻醉，腹主动脉采血，分离血清，灭活，过滤，-20 ℃冷藏备用。
2.1.4 操作步骤：膈下逐瘀汤药物血清处理Bel-7402细胞0 min、30 min、1 h、3 h、6 h后，应用Western Blot法检测PTEN蛋白。用细胞刮子每组收集药物血清培养不同时间后的106个细胞，加入裂解液(50 mmol/L Tris-HCL，pH 6.8，50mMβ-巯基乙醇，2%SDS，0.1%溴酚兰，10%甘油)，提取15 ?滋l蛋白上样进行SDS-PAGE，用4%积层胶（0.5 mmo1/L Tris-HCL，pH 6.8，2.5 ml，10% SDS 0.1 ml，30%聚丙烯酰胺1.33 ml，蒸馏水6.1 ml，10%过硫酸铵50 ?滋l，TEMED 10 ?滋l）、10%分离胶（1.5 mmo1/L Tris-HCL，pH 8.8，2.5 ml，10% SDS 0.1 ml，30%聚丙烯酰胺3.3 ml，蒸馏水4 ml，10%过硫酸铵0.1ml，TEMED 10 ?滋l）电泳，积层胶上所加电压为8 V/cm2；电泳完毕后进行转膜，电流0.65 mA/cm2，电转时间为2 h；封闭1.5 h，弃去封闭液，PBS漂洗10 min×3；加入PTEN蛋白多克隆抗体(1∶200稀释)-4 ℃孵育过夜，PBS漂洗10 min×3，加入二抗辣根酶标记羊抗兔IgG(1∶2000)，室温孵育1 h，缓冲液漂洗10 min×3；利用化学发光法进行显色反应，KODAK X胶片显影。
2.2 体内实验
2.2.1 造模方法：将35只雄性Wistar大鼠随机分为5组：正常对照组，肝癌模型组，顺铂组，膈下逐瘀汤组，联合治疗组，每组7只大鼠。造模参考吴仕九[2]、王锦波[3]方法。腹水型Walker-256肿瘤细胞株注射入大鼠皮下，长出皮下实体瘤，取瘤体周边鱼肉样组织剪成约2 mm3小块，实验组大鼠麻醉后，剖开腹腔，暴露肝脏，以眼科镊将瘤块植入肝脏包膜下，用可吸收凝胶海绵塞填压迫，防止瘤块脱出及出血，关闭腹腔，术后注射青霉素针剂（20万U/d，连续3天）。正常对照组不造模，予普通饲料饲养，置于普通环境。膈下逐瘀汤组大鼠给予膈下逐瘀汤水煎剂灌胃，0.740 g/ml，每天1次，连续15 d；顺铂组大鼠给予顺铂腹腔注射，0.300 mg/ml，隔天1次，共7次；联合治疗组大鼠给予膈下逐瘀汤和顺铂联合治疗，剂量及用法同上述两组。造模第二十天处死所有动物，取新鲜肝组织迅速置于液氮中保存。
2.2.2 操作步骤：取大鼠肝组织1 g，加入0.5 ml组织裂解液（Tris-HCL 50 mmol/L，pH 7.5；NaCL 150 mmol/L；NP-40 1%；脱氧胆酸钠0.5%；SDS 0.1%；EDTA 1 mmol/L；PMSF 1 mmol/L），进行组织匀浆，10 000 r/min离心10 min，取15 ?滋l蛋白上样进行SDS-PAGE，其余步骤同体外实验。
3 结果
3.1 膈下逐瘀汤对Bel-7402细胞PTEN蛋白水平的调节作用：（1）膈下逐瘀汤作用Bel-7402细胞30 min后，PTEN蛋白水平逐渐增高，至3 h，PTEN蛋白水平达到最高水平，至6 h，PTEN蛋白恢复至正常水平（见图1）。（2）与正常对照组比较，各组药物作用肝癌Bel-7402细胞3 h后PTEN蛋白的表达均有差异，但联合治疗组差异最为明显，膈下逐瘀汤组次之，顺铂组居后（见图2）。
3.2 Western blot法检测大鼠肝癌组织PTEN蛋白调节作用：与正常对照组相比，肝癌模型组、顺铂治疗组、膈下逐瘀汤和联合治疗组PTEN蛋白表达均增高；与肝癌模型组相比，顺铂治疗组、膈下逐瘀汤和联合治疗组的PTEN蛋白表达显著增高，有明显差异；与顺铂治疗组比较，膈下逐瘀汤和联合治疗组的表达增高，但联合治疗组差异更为显著（见图3）。
4 讨论
抑癌基因PTEN，也称MMAC1（mutated in multiple advanced
cancers)或TEP 1（TGFβ-regulated and epithelialcell-enriched pho-
sphatased），是一个定位于10q23.3新的候选抑癌基因，它编码一个具有双特异性磷酸酶活性蛋白质，其大小为403个氨基酸，该酶对酸性多肽polyGlu4Tyr1具有高度特异性，其磷酸酶活性的丢失常常与生殖细胞和体细胞起源的突变密切相关[1]。自1997年国际上3个研究小组相继独立地克隆到这种新的具有相同cDNA序列的、具有蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的抑癌基因后，PTEN基因立即成为细胞信号转导、分子生物学和肿瘤病理学等领域的研究热点，是继p53基因发现之后的又一个“明星分子”。PTEN不仅在细胞周期阻滞、细胞凋亡中起重要作用，在细胞黏附、转移及分化的调节等细胞生理方面也有重要作用[4，5]。
“肝血瘀阻”是肝癌后期病因病理。血瘀是形成�块的一个重要因素。实验研究证实，活血化瘀能改善结缔组织代谢，改善微循环，增强内皮系统的吞噬功能，减少病变部位的缺血，增加肝脏的营养与氧供，从而加速病理组织的吸收与修复。因此，多年来，人们一直以活血化瘀为肝癌的主要治则。清・王清任《医林改错》中曾指出：“无论何处，皆有气血，气无形，不能结块，结块者必有形之血也。血受寒则凝结成块，血受热则煎熬成块。”强调瘀积痞块的形成与瘀血相关，治应理气活血，创膈下逐瘀汤以治之。该方有活血祛瘀、行气止痛之功，主治膈下瘀血，形成积块，或小儿痞块，或肚腹疼痛，痛处不移，或腹胀腹坠等。故临床治疗应以活血祛瘀、行气通滞为其基本治法。
本研究中，通过体外及体内实验分别观察了经方膈下逐瘀汤对肝癌Bel-7402细胞和大鼠肝癌组织中PTEN蛋白的表达的影响。而通过Western blot法发现，膈下逐瘀汤促进Bel-7402细胞和肝癌组织中PTEN蛋白的表达，膈下逐瘀汤的作用机制可能就是通过促进Bel-7402细胞和肝癌组织中PTEN蛋白的表达，从而阻断了肝癌的发生发展。PTEN蛋白水平的增高可能是膈下逐瘀汤抗肝癌的主要作用机制之一；膈下逐瘀汤与抗肿瘤药顺铂有协同抗肝癌的作用。
参考文献：
[1] Tian XX，Pang JC，To SS，et al.Restoration of wide-type PTEN ex-pression leads to apoptosis，induces differentiation and reduces telo-merase activity in human glimo cells[J].Neuropathol Exp Neurol，1999，58(5)：472.
[2] 吴仕九，杨运高，杨钦河，等．温病湿热证动物模型的研制及清热祛湿法机理的探讨[J]．中国中医药科技，1999，6（2）：65.
[3] 王锦波，吕 毅，潘承恩，等．W256大鼠肝癌模型的制作及传代保存[J]．肝胆外科杂志，1995，3（2）：121.
[4] Waite KA，Eng C.Protein PTEN:Formand Function[J].Am J Hum Genet，2002，70(4)：829.
[5] Weng LP，Brow JL，Eng C，et al.PTEN coordinatesG1arrest by down regulating cyclinD1 viaits protein phosphatese activity and upregu-lating p27 viaits Lipid phosphatase activity[J].Hum Mol Genet，2001，10(6):599.
收稿日期：2008-02-01
