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文章编号：1009-5519（2008）13-1981-02 中图分类号：R9 文献标识码：A 金属β-内酰胺酶又称金属酶，属Bush功能分类中的第三组，Ambler分子结构分类中的B类。这类酶能够水解几乎所有的β-内酰胺类抗生素，但对单环类抗生素敏感，其活性不被β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦抑制，但可被金属螯合物如乙二胺四乙酸（EDTA）及巯基化合物等所抑制。现对IMP型MBLs的研究情况做一综述。
1 IMP型MBLs的特点、功能及传播机制
IMP家族多数由IMP-1突变产生，与其同源性较高，但各亚型对底物的水解活性不尽相同，这主要与各自的结构特点有关。IMP-1是第一个被发现的获得性MBL，水解底物谱较广，包括广谱头孢菌素类及碳青霉烯类抗生素；blaIMP-1基因位于质粒介导的I类整合子上，并已在肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌及其他非发酵革兰阴性杆菌中广泛传播[1]。1995年，Arakawa等[2]发现blaIMP-1基因盒位于一个新的大质粒介导的整合子样元件上，后来将这种新的元件命名为Ⅲ类整合子。IMP-3与IMP-1相比，仅有2个氨基酸替代，而其中196位丝氨酸（Ser）残基被甘氨酸(Gly)残基取代，导致其不能水解青霉素、氨苄西林、亚胺培南和头孢他定，与之对应的，存在blaIMP-3基因核苷酸序列640位鸟嘌呤代替腺嘌呤，这表明由于点突变使IMP-1的作用底物谱增宽，由此认为IMP-3可能是IMP-1的祖先。blaIMP-6基因的核苷酸序列也存在着相同的碱基转换，导致196位Gly替代Ser，这种点突变使IMP-6对帕尼培南，尤其是美罗培南的水解活性明显强于亚胺培南，这与IMP－1相反，表明IMP-6具有更广的底物谱。但其抗青霉素G、哌拉西林的活性显著降低[3]。进一步研究显示，blaIMP-4位于I类整合子上，其下游还存在其余3个耐药基因盒qacG2、aacA4及catB3，分别编码对季胺化合物、氨基糖甙类及氯霉素耐药性[4]。IMP-5与IMP-1、IMP-3及IMP-4的同源性大于IMP-2，分别为93%、92%、91%和87%，其PI为9.3，表现为对青霉素类、广谱头孢菌素类及氨曲南高度耐药，但对氨苄西林/舒巴坦、氨基糖甙类和喹诺酮类抗生素敏感；blaIMP-5基因单独位于I类整合子上[5]。产IMP-7的铜绿假单胞菌曾在加拿大的两个医院引起爆发流行，该菌株对碳青霉烯类、氨基糖甙类、环丙沙星及头孢他定耐药，但对哌拉西林敏感；核苷酸序列分析表明，IMP-7与IMP-1的同源性为91%；blaIMP-7基因位于I类整合子的第三个基因盒位置，与其相邻的两个基因盒分别为aacC4和aacC1，均编码对氨基糖甙类耐药性[6]。IMP-10与IMP-1相比，由于一个碱基的改变，导致49位缬氨酸代替苯丙氨酸，这一改变使得IMP-10对青霉素类水解活性明显下降，而对头孢菌素及碳青霉烯类水解能力影响不大；包含blaIMP-10的基因盒被插入于整合子上的一个特定位点GTTRR RY之中，基因盒的核苷酸序列与blaIMP-1基因盒相同，表明blaIMP-10基因和blaIMP-1一样能在不同菌株之间转移，从而导致产IMP型MBLs菌株的播散。
IMP-2与IMP-1同源性为85%，动力学参数显示，两者对头孢西丁、头孢他定、头孢吡肟及亚胺培南的水解活性相似，但对氨苄西林、羧苄西林、美罗培南及头孢噻啶明显不同；blaIMP-2基因盒位于I类整合子上，但其59be与blaIMP-1不同，表明编码这两种IMP变异体的基因盒起源不同[7]。2001年，我国台湾省一株多重耐药的肺炎克雷伯杆菌中发现的质粒介导的IMP-8，与IMP-2相比仅有2个氨基酸差异，其同源性大于IMP-1，产IMP-8的转化株大肠杆菌，表现为对青霉素类、头孢菌素类及碳青霉烯类的敏感性降低，而对氨曲南依然敏感；blaIMP-8基因盒与编码对氨基糖甙类耐药的基因aacA4共同位于质粒来源的I类整合子上[8]。IMP-12与其他IMP酶差别较大，同IMP-8和IMP-2关系最近，一致性分别为88.6%和88.2%，与IMP-1的一致性为85%，其基因位于50kb大小的非自传递型质粒pVA758上；动力学分析显示，IMP-12对青霉素类水解活性较弱，不能水解甲氧青霉素和氨曲南，与IMP-1相比一个显著的特点是，其对亚胺培南具有相当高的Km值，为920 μM。IMP-13与IMP-8和IMP-2的一致性分别为93%、92.3%，blaIMP-13位于I类整合子第一个基因盒位置，表明该基因盒于近期才获得，与其紧邻的是一个编码氨基糖苷修饰酶基因aac(6")-Ib"。IMP-14与IMP-11一致性最高（92.4%），其次为IMP-8（87.7%），对β-内酰胺类抗生素的水解活性普遍较低；blaIMP-14基因同样位于I类整合子上，其上游含有一个改变了的启动子，下游含有一个与aacA29一致性30%的基因，编码对氨基糖甙类耐药。目前认为blaIMP-14的低表达及对碳青霉烯类的耐药性降低可能与启动子的改变有关[9]。IMP-16与IMP-11及IMP-8一致性最大，分别为90.3%、89.5%；动力学显示，IMP-16对β-内酰胺类抗生素的水解活性不及IMP-1，优先水解头孢菌素及碳青霉烯类，与其他IMP酶在功能上主要不同是，IMP-16不能水解头孢西丁，对亚胺培南的kcat/Km值较低；blaIMP-16基因位于I类整合子上，其下游有一个编码氨基糖苷修饰酶的融合型基因aac(6")-30/aac(6")-Ib"和一个aadA1基因。2006年，美国首次从铜绿假单胞菌中发现IMP-18，PCR产物由781bp核苷酸序列组成，IMP-18与其他IMP酶差别较大，同IMP-14及IMP-8关系最近，一致性分别为91%、88%[10]。
我国广州分离的7株IMP-9阳性铜绿假单胞菌药物敏感试验显示，部分菌株对碳青霉烯类中介甚至敏感，而美罗培南较亚胺培南表现出更大的抗菌活性，同时这些菌株对环丙沙星、阿米卡星及庆大霉素敏感或临界耐药；IMP-9与其他IMP家族的一致性为78%～91%；blaIMP-9基因由450 kb左右的大质粒IncP-2携带，在整合子上基因盒按以下顺序排列：aacA4→blaIMP-9→aacA4→catB8→blaOXA-10；随机扩增多态性DNA分析显示，除了菌株96和121，其余均非来源于同一克隆，加之blaIMP-9位于可转移的质粒上，提示这一地区产IMP-9碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌的传播主要由基因的水平传播引起。
2007年，在由城市污水中分离出来的萤光假单胞菌中发现了blaIMP-22，其位于I类整合子上，包含741bp的开放读码框架（open reading frame，ORF），编码一个含246个氨基酸的前蛋白，即IMP-22；IMP-22与其他IMP酶差别很大，与IMP-16关系最近，一致性为94%，与IMP-1的一致性为85%；产IMP-22的萤光假单胞菌对亚胺培南、美罗培南、头孢噻肟及头孢他定高度耐药，但对青霉素类敏感。除小部分blaIMP-1基因存在于Ⅲ类整合子，绝大多数blaIMP基因位于Ⅰ类整合子上。整合子由三部分组成：3"、5"保守区和两者之间的可变区。I类整合子典型的结构为：5"保守区含有编码整合酶的intI基因、与之相邻的重组位点(attI)及负责基因转录的启动子；3"保守区含有分别编码对季铵化合物及磺胺类药物耐药性的qacE△1基因和sul1基因，并含有功能未知的orf5；可变区由基因盒插入位点和参与耐药基因重组的59be组成。整合子通过整合酶的作用可以捕获多个基因盒，借助启动子的作用得以表达，使细菌具有耐药或多重耐药性。整合子本身不能移动，但可以位于质粒或转座子等可移动基因元件上进行传播，从而导致耐药基因在细菌中的播散。
2 IMP型MBLs的检测方法
目前CLSI关于MBLs的表型检测尚无推荐方法。主要包括纸片扩散法、微量稀释法和E试验。这些方法各有优缺点：纸片扩散法操作简单、快速，结果相对容易判断，灵敏度和特异度较高，但药敏纸片及纸片之间的距离未标准化；微量稀释法可直接测定最低抑菌浓度（MIC）值，结果容易判断，但劳动强度大；E试验操作简单，结果容易判断，灵敏度、特异度也较高，但不能检测出低水平耐药菌株，且成本较高。上述表型试验的原理是金属螯合剂可与酶活性中心的锌离子结合，从而抑制MBLs的活性。然而，部分产IMP酶的细菌，如大多数肠杆菌科细菌表现为对碳青霉烯类抗生素中介或敏感，因而当用美罗培南或亚胺培南对产IMP酶的肠杆菌科细菌进行表型检测时，就会出现假阴性。等电聚焦电泳(IEF)也可用于某些β-内酰胺酶的检测，它主要利用各种酶的表面电荷不同来测定其PI值，可以提供未知MBLs的PI值。但由于部分MBLs的PI值相近，而在结构上相差巨大，故IEF存在一定的局限性。基因型检测方法主要包括PCR法、DNA探针法和测序法，它们都是从基因水平上进行检测和分析，灵敏度和特异度都较高。PCR法需要特定的引物，DNA探针法需要特定的探针，两者都不能区分各亚型，也不能用于发现新的基因型。最近Mendes等[11]用实时PCR法检测MBLs基因，结果显示该方法能快速（2小时）检测出所有含MBLs基因菌株，其结果与基因测序完全一致，但其同样只能用于已知基因的鉴定。测序法是目前公认的IMP型MBLs基因分型的金标准，但该方法操作步骤烦琐，所需时间较长，费用高，需要昂贵的仪器，因此不宜作为一种筛查的方法，可用于IMP型MBLs的分子流行病学监测。脉冲场凝胶电泳(PFGE)的原理大致为:将细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对细菌染色体进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件而得到分离。PFGE可用于了解各型IMP酶的同源性，也可用于分子流行病学研究，其重复性好，分辨率强。但同样存在操作步骤繁琐、费用高及需要特殊仪器等缺点，而不能用于常规检测。
3 产IMP型MBLs菌株引起感染的治疗措施
IMP型MBLs能水解除单环类抗生素以外的几乎所有β-内酰胺类抗生素；加上blaIMP基因常与编码对其他抗生素耐药的基因，如氨基糖甙类耐药基因，共同位于整合子上；而且IMP阳性细菌如铜绿假单胞菌、不动杆菌及部分肠杆菌科细菌等，往往同时存在其他耐药机制，如产生头孢菌素酶、药物主动外排和外膜蛋白丢失或减少等，因而这些细菌通常表现为对β-内酰胺类、氨基糖甙类及氟喹诺酮类抗生素耐药。产IMP型MBLs菌株引起人类感染的报道已屡见不鲜，但目前尚无合适的治疗方案。Bellais等[12]设计动物模型，用抗生素治疗产VIM-2的铜绿假单胞菌感染所致的小鼠肺炎研究中发现，大剂量氨曲南对治疗有效。但关于产IMP酶细菌引起的感染及应用于人类感染的研究还未见报道。金属螯合剂在体外可以抑制MBLs的活性，但尚不能应用于人体。
目前多粘菌素类抗生素被认为是治疗医院感染多重耐药革兰阴性细菌的最后防线。最近许多报道证实，多粘菌素类抗生素在治疗多重耐药革兰阴性细菌所致严重的医院感染方面安全、有效，同时发现其肾毒性及神经毒性并不像以前文献报道的严重。目前关于多粘菌素类抗生素的有效剂量、疗程、临床适应症及安全性亟待进一步研究。
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收稿日期：2008-04-01
