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【摘要】 目的 探讨耐药铜绿假单胞菌（PA）中是否存在主动外排系统，以揭示PA对氟喹诺酮类药物的耐药机制。方法 检测碳酰氰间氯苯腙（CCCP）对16株PA药物MIC的影响；荧光法检测PA耐药菌和敏感菌对环丙沙星（CIP）的摄取，以及加入CCCP后对CIP累积量的变化情况。结果 外排泵阳性株为4株，CCCP可以使PA 16菌体内环丙沙星的累积量显著上升，而其它菌株中加入CCCP后，环丙沙星的累积量变化不大。结论 本地区PA中可能存在氟喹诺酮药物的主动外排系统。�
【关键词】 铜绿假单胞菌；氟喹诺酮药物；主动外排系统��
Effects of pump inhibitor on accumulation of ciprofloxacin in pseudomonas aeruginosa clinical isolates ZHAO Ting-kun, MAO Shu-mei, SHI Li-hong, et al. Department of Pharmacology, Applied Pharmacological Laboratory，Weifang Medical University, Weifang 261042, Shandong Province，China�
【Abstract】 Objective To explore whether active efflux system is present in P. aeruginosa in order to identify the resistance mechanism of P. aeruginosa to Fluoroquinolones antibiotics. Methods The influence of carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone (CCCP) on MICs of antibiotics to P. aeruginosa clinical isolates were tested by agar dilution according to NCCLS. The accumulation of ciprofloxacin in P. aeruginosa were measured by a fluorescence method and the influence of CCCP was analyzed. Results 4 P. aeruginosa isolates had the efflux pumps for β-lactam antibiotics or fluoroquinolones. CCCP could dramatically increase the accumulation of ciprofloxacin in P. aeruginosa PA16. However, CCCP had little effect on the accumulation of ciprofloxacin in other P. aeruginosa clinical isolates. Conclusion There may have an active efflux system targeting fluoroquinolones in P. aeruginosa.�
【Key words】 P.aeruginosa; Fluoroquinolones; Active efflux system
铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是医院常见条件致病菌之一，临床分离株多重耐药直接影响感染的治疗，因而研究耐药机制指导合理用药是大家关注的热点[1]。本试验对临床分离的PA进行环丙沙星（CIP）的摄取分析，探讨PA的多重耐药和主动外排泵的关系及泵抑制剂的作用，为临床抗感染治疗提供初步的理论依据，现报告如下。�
1 材料与方法�
1．1 菌株 由附属医院自PA临床分离株中筛选出对CIP的耐药菌8株和敏感菌8株。质控标准菌株ATCC27853由四川抗生素工业研究所提供。�
1．2 主要试剂 CIP中国药品生物制品检定所；头孢噻肟（CTX），头孢他啶（CAZ），哈尔滨誉衡药业有限公司；碳酰氰基-间-氯苯腙（CCCP）Sigma公司。�
1．3 主要仪器 Sakuma MIT-P细菌多点接种仪（日本）；TU-1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Eppendorf 5810R型冷冻离心机（德国）；R540型荧光分光光度计(日本岛津公司)。�
1．4 泵抑制剂CCCP对抗菌药物MIC的影响 制备CCCP浓度为3 μg/ml的抗生素琼脂平皿和仅含3 μg/ml CCCP的琼脂平皿。操作参照琼脂稀释法测定MIC[2]。结果判断[3]：将应用CCCP后MIC值降至原值1/4或以下的菌株判为外排泵阳性。�
1．5 PA对CIP摄取分析�
1．5．1 标准曲线 用0．1 mol/L 盐酸-甘氨酸缓冲液（pH3．0）配制6．25、12．5 、25、50、100、200 ng/ml不同浓度的药物溶液，制备标准曲线。�
1．5．2 摄取分析 细菌在MH肉汤中37℃培养至A 值，OD600＝0．1，收集菌体，离心称重后用0．05 mol/L PBS配成浓度20 mg/ml的菌悬液。各取10 ml菌悬液于两烧瓶中，其中一烧瓶加入CCCP至终浓度10 μg/ml，皆于37℃振摇孵育；于10 min后两瓶皆加入CIP至终浓度10 μg/ml。加入药物后，间隔0、3、8、15、23、30 min吸取菌液0．5 ml，立即加2 m1预冷的PBS，4℃离心，沉淀用缓冲液冲洗1次；同样条件冲洗一次，沉淀加入0．1 mol/L 盐酸-甘氨酸缓冲液2 ml，用漩涡振荡器剧烈振荡混匀细菌，置室温2 h，于4℃离心5 min，取上清液测定。�
1．5．3 荧光测定 激发波长：280 nm，发射波长：465 nm 。�
1．5．4 统计学方法 数据均以（x±s）表示，采用方差分析检验判断各组间差异的显著性。�
2 结果�
2．1 CCCP对菌株MIC的影响 16株菌中，外排泵阳性株为4株，其中对CAZ, CTX及CIP有外排作用的菌株数分别为1、3、1株，PA 16同时外排CTX和CIP。结果见表1。�
2．2 PA对CIP的摄取分析 敏感株和耐药株对CIP摄取均在15 min左右基本达到平衡，耐药菌的细胞内CIP稳态浓度低于敏感菌（P＜0．01），差别有统计学意义。敏感组与耐药组之间不同时间的CIP摄取量均存在差异（P＜0．01），敏感株CIP的摄取量大于耐药株组，结果见表2。�
2．4 CCCP 对CIP在PA细胞内聚积的影响
耐药株PA 16未加CCCP时CIP的最高累积浓度(15 min) 是10．06 ng/mg，加入CCCP时最高累积浓度为40．07 ng/mg（见图1）。但其他菌株未加和加入CCCP时，CIP累积浓度变化较小。�
3 讨论�
主动外排系统是细菌抵御外界不良环境的重要手段，是一些致病菌内源性和获得性多重耐药的最重要原因[4]。主动外排泵抑制剂CCCP是一种抑制质子转运的解偶联剂，可以破坏跨膜质子浓度梯度，使外排蛋白失去能量来源，使药物在细菌体内的蓄积量增加，恢复细菌对药物的敏感性。�
本研究，MIC结果表明，16株菌株中外排泵阳性株为4株，其中对CAZ、 CTX及CIP有外排作用的菌株数分别为1、3、1株，PA16同时外排CTX和CIP，说明本地区菌株存在主动外排系统。CCCP可以使菌体PA16内CIP的累积量上升4 倍多，而对其他16 株细菌CIP的累积量影响有限，可以推断PA16存在针对CIP的主动外排系统，但并非每株耐药菌均存在泵机制的参与，即使有泵机制的参与，其作用大小也不相同。�
主动外排系统抑制剂与抗菌药物的联合应用在临床上具有广阔的前景。现在对于主动外排抑制剂的研究主要局限于体外试验结果，CCCP 对机体有毒性作用，从药物研发的角度寻求更加有效且安全无毒的外排泵抑制剂，使其与氟喹诺酮类药物联合应用，将会克服某些耐药菌的耐药现象，达到临床有效治疗的目的。�
参考文献
［1］ Stover CK, Pham XQ, Erwin AL, et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAOl, an opportunistic pathogen. Nature. 2000, 406: 959-964.�
［2］ 徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学(第二版),人民卫生出版社，2002:1659.�
［3］ Valdezate S, Vindel A, Echeita A, et al. Topoisomerase Ⅱand Ⅳ quinolone resistance- determining regions in Stenotrophomonas maltophilia clinical isolates with different levels of quinolone susceptibility. Antimicrob Agents Chemother, 2002, 46: 665.�
［4］ 赵廷坤，凌保东，周岐新.铜绿假单胞菌主动外排系统研究进展.四川生理科学杂志，2004，26（3）：126-130.�
