【www.zhangdahai.com--庆典致辞】
摘要：目的：以兔血清白蛋白和IgG的分离纯化与鉴定实验为例，阐述了血清蛋白制备与分析的过程。方法：使用了硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析、DEAE离子交换层析、亲和层析、醋酸纤维薄膜电泳、SDS-PAGE、HPLC等分离纯化鉴定蛋白质的方法。结果：制备了兔血清白蛋白和γ－球蛋白(IgG)，测定被分离物质的相对分子量，鉴定纯化产品的均一性。结论：该实验作为一门生物综合性大型实验，非常有利于培养学生掌握蛋白质制备与分析的综合技能。
关键词：分离纯化；白蛋白；γ－球蛋白；实验
中图分类号：Q503
文献标识码：A
文章编号：1008－2409(2007)03－0424－03
血清白蛋白是人体内重要的营养物质，在血液中有重要生理功能，是血液总渗透压的主要调节物质，其浓度可以反映肝脏的功能，其水平的改变能导致一系列的病理性继发症。血清白蛋白的另一作用是作为脂肪酸的载体参与运送脂肪酸。此外，血清白蛋白还有重要的药用价值，注射白蛋白针剂可治疗浮肿等症。
血清球蛋白是血清蛋白质的重要组成部分，能与外来的特异性抗原起免疫反应而保护机体。检查血清总蛋白及白、球蛋白的比值，即可了解肝脏受损害的程度。总蛋白下降、白／球蛋白比值减少、电泳试验γ－球蛋白增加，是肝炎的常见情况。
因此，测定血清白蛋白常用于患者状态的非特异监视。
1 材料与方法
1．1材料试剂与仪器
1．1．1材料兔血清。
1．1．2 试剂 饱和(NH4)2SO4溶液、磷酸盐缓冲液(pH6.3)、Sephadex G－25、二乙氨乙基(DEAE)纤维素、三氯醋酸、0.5mol／L醋酸铵缓冲液(pH6.5)、0.06mool／L醋酸铵缓冲液(pH6.5)、0.02tool/L醋酸铵缓冲液(pH6.5)、SPA-Sepharose－4B、结合缓冲液(pH8.9)、缓冲液I(pH7.0的PBS)、缓冲液I(pH 3.0的PBS)、Tris-Hcl缓冲液(pH8.5)、柠檬酸溶液(pH3.0)、0.9％NaCI溶液、标准血清白蛋白液、考马斯亮蓝G250等。
1．1．3仪器层析柱，离心机，恒流泵，核酸蛋白检测仪，记录仪，电泳仪，垂直平板电泳槽，微量注射器，Agilent-1100-高效液相色谱仪、紫外可见分光光度计等。
1．2方法
1．2．1血清白蛋白的分离与纯化①硫酸铵盐析法制备粗白蛋白液：取2.0ml兔血清于管中，逐滴加入饱和硫酸铵溶液2.0ml。室温静置10min，3000r／min离心10min。移液枪小心吸出上层清液作为纯化白蛋白之用。②凝胶柱层析获得除盐白蛋白液：Sephadex G-25层析柱以0.02mol／L醋酸铵缓冲液(pH6.5)平衡，以流速1ml／min洗脱粗制白蛋白液获得除盐的白蛋白液。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm／h、100mV，同时记录吸光度值。③DEAE-纤维素离子交换层析柱分离白蛋白：装好的DEAE-纤维索离子交换层析柱以0.02mol／L醋酸铵缓冲液(pH6.5)平衡，将去盐收集得的白蛋白液加到纤维素柱上，接上恒流泵，用0.06～0.5mol／L醋酸铵缓冲液(pH6.5)以流速为1ml／min进行梯度洗脱。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm／h、100mV，同时记录吸光度值。
1．2．2血清．γ-球蛋白的分离与纯化①硫酸铵盐析获得粗制γ-球蛋白液：取2.0ml兔血清于管中，逐滴加入饱和硫酸铵溶液2.0ml。室温静置10min，3000r／min离心10min，用移液枪小心吸出上层清液作为纯化白蛋白之用，沉淀用0.5ml的0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)溶解作为纯化γ-球蛋白之用。②凝胶柱层析获得除盐粗制γ-球蛋白液：Sephadex G-25层析柱经0.02mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.5)平衡后，0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)以流速1ml／min洗脱粗制γ-球蛋白液。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm／h、200mV，同时记录吸光度值。③DEAE-纤维素离子交换层析柱分离γ-球蛋白：将装好的DEAE-纤维素离子交换层析柱先经0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡后，在纤维素床面上以流速为1ml／min的0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)进行洗脱。核酸蛋白检测仪在0.05A档、走纸速度6cm／h、100mV，同时记录吸光度值。④亲和层析法纯化γ-球蛋白33：用恒流泵，以结合缓冲液平衡柱，流速为0.5ml／min。将DEAE-纤维素离子交换层析后的γ-球蛋白溶液上柱，用结合缓冲液洗柱。依次分别用5倍床体积的缓冲液I～I洗脱(流速0.5 ml／min)，缓冲液I洗脱IgG1，缓冲液I洗脱IgG2。每管中预先盛有1mol／L Tris-Hcl缓冲液500μl，收集各吸收峰的蛋白液。透析除盐，冻干。
1．2．3测定白蛋白及γ-球蛋白浓度用考马斯亮蓝法对经适当稀释后的各蛋白样品进行浓度的测定。
1．2．4 电泳①醋酸纤维薄膜电泳；②SDS-PAGE电泳装好垂直平板电泳槽后，微量注射器依次向凝胶梳孔内加样。调电泳仪电压至80V，待电泳条带成一条线时调节电压至110V，待溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时停止电泳。将凝胶小心取出，置于一大培养皿中，加染色液染色过夜，倾出染色液，加入脱色液脱色至背景清晰。对照Marker，观察结果。
1．2．5 HPLC鉴定纯化样品的均一性①试剂：色谱级纯乙腈(AN)、色谱级纯三氟乙酸(TFA)、超声脱气的双蒸水(ddH2O)。②参数设定：B流动相：ddH2O+TFA 70％；D流动相：AN 30％；Flow：0.8 ml／min压力：Max 230 pa，Min 30pa检测波长：280nm。⑨梯度洗脱设置。④上样准备及上样。⑤分析完毕后，在offline状态分析数据。
2 结果与分析
2．1实验原始数据
2．1．1凝胶柱层析结果：7一球蛋白凝胶柱层析OD值按试管1～4依次为：0.50～0.70，0.70～0.65*，0.65～0.50，0.50～0.18，取试管2，3收集液进行DEAE-纤维素离子交换层析；白蛋白凝胶柱层析OD值按试管1～5依次为：0.10～0.40，0.40～0.46，0.46～0.44*，0.44～0.38，0.38～0.20，取试管2，3收集液进行DEAE-纤维素离子交换层析。分别取以上带*的 OD值对应的试管收集液(即γ-球蛋白脱盐层析样品、白蛋白脱盐层析样品)，测浓度。
2．1．2 DEAE-纤维素离子交换层析结果：γ-球蛋白DEAE-纤维素离子交换层析OD值按试管1～4依次为：0.01～0.06，0.06～0.03*，0.03～0.02，0.02～0.01；白蛋白DEAE-纤维素离子交换层析OD值按试管1～4依次为：0.00～0.17，0.17～0.45，0.45～0.69*，0.69～0.42。分别取以上带*的OD值对应的试管收集液(即γ-球蛋白DEAE层析样品、白蛋白DEAE层析样品)，测浓度。
2．1．3考马斯亮蓝标准曲线原始数据见表1。
2．2结果分析
2．2．1 兔血清白蛋白和IgG的凝胶层析KDEAE纤维素柱层析的分离纯化结果分析①兔血清经饱和硫酸铵沉淀后粗分离得到的血清白蛋白和γ-球蛋白，通过Sephadex G-25柱层析脱盐后均为待分离粗产物的主要成分，图谱结果均为一单一清晰的尖锐峰。②pH大于6.8的γ-球蛋白在pH6.3的磷酸盐缓冲液中被直接洗脱出，因此γ-球蛋白的DEAE纤维素柱层析结果也为一清晰峰，上升较快。白蛋白DEAE层析结果，为一清晰尖锐的峰。由此说明层析效果比较理想，达到了进一步纯化的目的。
2．2．2 醋酸纤维薄膜电泳结果 由电泳图谱显可见：白蛋白、γ-球蛋白样品均只出现一条带，说明样品较纯。血清样品出现五条带，与文献一致。
2．2．3 IgG的亲和层析结果分析该实验以pH8.9的结合缓冲液平衡柱，γ-球蛋白上柱后留在柱上，再用该缓冲液冲洗，将杂蛋白洗脱出使基线稳定，然后先调缓冲液pH值至中性，洗脱出IgG1，再调至pH3.0，洗脱出IgG2。通过亲和层析图谱可见：第1个组分峰尖比较低(一般来说峰面积代表含量)，可知IgG1的含量比较少；第2个组分峰尖比较高，可知IgG2的含量较高。
2．2．4 SDS-PAGE凝胶电泳结果分析 各样品在SDS-PAGE凝胶电泳中跑出清晰的条带：白蛋白脱盐层析样品、白蛋白DEAE层析样品、γ-球蛋白脱盐层析样品、γ-球蛋白亲和层析pH7.0收集样品(IgG1)、γ-球蛋白亲和层析pH3.0收集样品(IgG2)以及Marker的电泳条带。其中γ-球蛋白脱盐层析样品、γ-球蛋白亲和层析pH7.0收集样品(IgG1)、γ-球蛋白亲和层析pH3.0收集样品(IgG2)均在50KD和25KD处出现条带，这是由于γ-球蛋白样品被sample buffer中的巯基乙醇打断二硫键，因此电泳后出现两条带。
2．2．5考马斯亮蓝法测定各样品浓度结果详见表2。
2．2．6 亲和层析后的γ-球蛋白HPLC分析――RP-HPLC测定蛋白质的均一性本次HPLC实验为反相高效液相色谱，利用极性溶剂三氟乙酸作为流动相。三氟乙酸酸化溶液，先使蛋白质呈疏水性留在柱上，然后逐渐增加乙腈的含量，利用相似相溶的原理，将非极性的蛋白质一次洗脱下来。
HPLC分析样品亲和层析的第一个组分IgG1，在4.019min时开始出现杂峰，接着又出现两个杂峰。在16.520min、16.755min、17.448min出现的三个主峰，都在适当的洗脱浓度范围内，可确定是IgG1。亲和层析时只看到一个峰，而HPLC分析发现出现三个峰，说明HPLC对样品的分析更加精细，这三个峰可能是IgG1的不同亚类。可能是由于IgG1不同亚类的重链、轻链有区别而不单一出峰，分别被洗脱出，且峰面积较窄，说明纯度较高。而这些亚类用亲和层析无法区分。
亲和层析第二个组分IgG2，在3.81min时出现第一个杂峰，接着又出现了较小的杂峰。在16.55min、16.76min、17.19min出现的三个主峰，在适当的洗脱浓度范围内，可确定是IgG2。而出现第四个峰时乙腈浓度在76％，所以对于这个峰是否是主峰，需进一步分析才知。之后是因为乙腈浓度过高造成蛋白质变性而洗脱下来，非所需成分。几个主峰与第一组分相似，不是单一出峰，可能是由于IgG2的重链和轻链有区别，分别洗脱出来。峰面积较窄，说明纯度较高。
HPLC分析亲和层析后第一个组分IgG1和第二个组分IgG2，重复性好，峰可互相对应。但是仍可看到细微的差别，首先出峰的时间不一致，IgG1在16.520min，IgG2在16.55min处，另峰值也不同，也排除了当初认为两个是同一样品的猜想。
[责任编辑 王慧瑾 高莉丽]
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方法(Methods)简要说明研究课题的基本设计，使用了什么材料和方法，如何分组对照，研究范围及精确程度，数据是如何取得的，经何种统计学方法处理。
结果(Results)简要列出研究的主要结果和数据，有什么新发现，说明其价值及局限。叙述要具体、准确，并给出结果的置信值、统计学显著性检验的确切值。
结论(Conclusion)简要说明经验证、论证取得的正确观点及其理论价值或应用价值，是否可推荐或推广等。
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