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[摘要] 目的 研究新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）对卵巢癌裸鼠移植瘤Survivin、Caspase-3表达的影响。方法 ①细胞培养：人卵巢癌细胞SKOV-3细胞的培养；②建立裸鼠移植瘤模型；③实验分组：分为实验组与对照组，实验组为肿瘤内注射NDV病毒抗卵巢癌； ④应用免疫组化SP法观察Survivin、Caspase-3的表达。结果 Survivin表达实验组与对照组均为阳性，实验组明显弱于对照组，差异有显著性（P＜0.05） ；Caspase-3表达实验组均为阳性，对照组1例表达，实验组明显强于对照组，差异有显著性（P＜0.05）。结论NDV可诱导肿瘤细胞凋亡，抑制其生长；其机制可能通过激活Caspase-3凋亡，抑制Survivin抗调亡作用。
[关键词]卵巢癌；NDV；裸鼠移植瘤；免疫组化
[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号]1673-9701（2011） 24-06-02
The Expression of Survivin and Caspase-3 in the Ovarian Cancer Nude Mice Transplanted Tumor by Newcastle Disease Virus
SU Lirong
Department of Obstetrics and Gynecology，Beijing Municipal Shunyi District Health Care Hospital for Women and Children， Beijing 101300， China
[Abstract] Objective To investigate the expression of Survivin and Caspase-3 in the ovarian cancer nude mice injected by Newcastle disease virus. Methods SKOV-3 tumor cells were cultured；the model of SKOV-3 transplanted tumor model in the nude mice were established. We injected the NDV into the transplanted tumor in experiment group，water was injected in control group；Immunohistochemistry SP was used to detect the expression of Survivin and Caspase-3. Results The expression of Survivin was positive in both A and B group and the stain result in group A was lighter than in group B（P＜0.05）. The expressions of Caspase-3 were all positive in experiment group，only had one in control group and experiment group was inferior than control group（P＜0.05）.Conclusion When NDV is injected into，apoptosis is induced and the growth of neoplastic cell is inhibited. The mechanisms may be through activation of Caspase-3 and inhibition of anti-apoptosis effect of Survivin.
[Key words] Ovarian cancer；NDV；Transplanted tumor in nude mice；Immunohistochemistry
卵巢恶性肿瘤严重威胁妇科肿瘤患者生命，生物治疗作为肿瘤治疗的模式日益受到重视。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是近年引起重视的一种病毒，有一定抑瘤作用。肿瘤的发生发展与细胞凋亡异常关系密切，凋亡的调控中凋亡抑制蛋白起重要作用。凋亡抑制蛋白Survivin通过抑制凋亡蛋白Caspase-3的活化或抑制己活化的蛋白酶活性发挥作用。Caspase-3是细胞凋亡调控中的关键蛋白酶，Survivin的抑制凋亡功能最强。
本实验研究NDV对卵巢癌裸鼠移植瘤细胞Survivin、Caspase-3表达的影响，进一步证实NDV可诱导肿瘤细胞凋亡，抑制其生长，其机制可能通过激活Caspase-3凋亡，抑制Survivin抗调亡作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 肿瘤细胞 卵巢癌细胞由哈尔滨市肿瘤医院细胞生物所提供。
1.1.2 动物 6周龄裸鼠22只，雌雄各半，16~18g，由北京动物中心提供。
1.2 试剂
新城疫病毒（NDV-D90）；胎牛血清；PBS磷酸盐缓冲液；RPMI-1640培养液 （GIBCO公司）；青霉素、链霉素；胰酶；其他试剂由实验室提供。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养 细胞株呈贴壁生长，用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液及在CO2体积分数为5%的37℃恒温箱中、于饱和湿度下进行培养。用胰酶使贴壁细胞成为细胞悬液，离心得到细胞沉淀，再加培养液10mL成重悬细胞，取0.5mL悬液进行活细胞计数，反复计数3次，实验中计数细胞总量，生理盐水洗涤2次，将细胞调为5×107/mL。
1.3.2 病毒培养与纯化 病毒保存液接种于鸡胚，37℃培养72h，扩增病毒。培养结束后，将接种的鸡胚放入4℃冰箱冷冻过夜。PBS调整NDV病毒密度为1×107pfu/mL，病毒分装冻存备用。
1.3.3 裸鼠卵巢癌模型的构建 裸鼠饲养在恒温（25℃～27℃）、恒湿（45%～50%）、无特殊病原菌（specific pathogen free，SPF）的条件，实验过程无菌，用一次性无菌注射器抽取SKOV-3细胞悬液约0.2mL注入实验裸鼠左侧腋部皮下，每只鼠设1个皮下接种点，每点接种0.2mL细胞悬液，约含1×107个肿瘤细胞。注射后7d左右，在小鼠左侧腋下长出大小一致肿瘤，即造模成功。
1.3.4 分组及病理观察 皮下接种肿瘤细胞7d建模成功后把裸鼠随机分成两组，每组均为8只（NDV组、对照组）。NDV组：瘤内注射NDV 0.3mL/只（病毒数约1×106pfu）；对照组：瘤内注射PBS 0.3mL/只；切取小块瘤组织标本，常规HE染色；免疫组化SP法。
1.4 结果判定
阳性细胞呈棕黄色着色，细胞着色强度分级：以多数阳性细胞呈现的颜色进行分类： 显色强度与背景无明显差别为阴性；显色程度为淡黄色或个别细胞呈黄至棕黄色为弱阳性（+），记1分；棕黄色中度阳性（++），记2分； 细胞呈棕黄色染色为强阳性（+++），记3分。阳性细胞百分数记分和细胞着色强度记分相加即为最终积分。
1.5 统计学处理
采用SPSS14.0统计软件进行数据处理。NDV对卵巢癌裸鼠移植瘤Survivin、Caspase-3表达的影响采用秩和检验分析，P ＜0.05为差异显著。
2 结果
2.1 HE染色
实验组：癌细胞旁有凋亡细胞，体积缩小，核固缩。对照组： 细胞核大，不规则，染色质浓缩，形态多样，有20%的坏死区。
2.2 免疫组织化学
2.2.1 皮下移植瘤Caspase-3表达 Caspase-3阳性染色主要位于细胞浆，呈棕黄色。NDV组均阳性表达，对照组Caspase-3只有1例表达，且NDV组棕黄染色明显强于对照组，两组差异有显著性（P＜0.05）。见图1、表1。
2.1.2 皮下移植瘤Survivin表达 Survivin阳性染色主要定位于细胞浆，也可见细胞核着色呈棕黄色，NDV组与对照组Survivin均为阳性表达，NDV组棕黄染色明显弱于对照组，差异有显著性（P＜0.05）。见图2、3及表2。
3 讨论
新城疫病毒 （NDV） 为不分节段的单股负链RNA 病毒[1]，关于NDV 治疗肿瘤的机制，Siba等[2]研究发现，新城疫病毒介导溶瘤的机制既包括内源通路也包括外源通路。2007年García-Sastre等[3]首次报道了应用重组NDV 病毒进行癌症治疗的研究。本实验确定新城疫病毒抗肿瘤作用，NDV对荷瘤裸鼠卵巢癌细胞Survivin、Caspase-3表达的影响，研究其对卵巢癌细胞的生长抑制作用。结果表明NDV 对卵巢癌细胞有抑制作用，NDV具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，与国外文献报道相符合[4]。
Caspase-3是Caspase家族核心蛋白酶，是凋亡关键酶。大多数细胞凋亡依赖于Caspase-3。当Caspase的活性受抑制引起细胞凋亡与增殖动态平衡失调，就引起多种肿瘤的发生、发展。NDV诱导肿瘤细胞凋亡是Caspase-3依赖的凋亡途径杀伤肿瘤细胞。实验HE染色光镜下见大量坏死区，癌细胞周边见凋亡细胞，细胞缩小、变圆，细胞核染色质致密、固缩，聚集于核膜下，说明NDV 可有效抑制肿瘤细胞生长。免疫组化Caspase-3在鼠移植瘤内几乎呈阴性表达，NDV注射后Caspase-3明显呈阳性表达，提示NDV诱导细胞凋亡与Caspase-3的激活明显相关。NDV能够明显促进细胞凋亡抑制瘤细胞生长，有明显抑瘤作用。细胞凋亡（apoptosis） 是控制细胞生存与死亡的关键机制。Survivin 是凋亡抑制蛋白（IAP） 家族成员之一。Survivin阳性染色主要定位于细胞浆，也可见细胞核着色，呈棕黄色。研究表明Survivin可通过多种调控机制发挥其强大的抗凋亡作用、促进细胞增殖；Survivin抗凋亡机制之一是通过抑制Caspase-3活性发挥抗凋亡作用。Survivin与Caspase-3结合抑制Caspases 的活性， 阻断细胞的凋亡过程，促进肿瘤细胞增生。
本实验证实卵巢癌皮下移植瘤Survivin表达为强阳性，而注射NDV组棕黄染色明显弱于注射生理盐水组，表明Survivin可能阻断细胞凋亡过程，促进了卵巢癌细胞不断增殖；Survivin可能直接作用于Caspase-3并抑制其活性，导致肿瘤细胞凋亡减少而抑制凋亡作用增强，肿瘤细胞过度增生。注射NDV后Caspase-3表达增加而Survivin表达减弱，提示NDV诱导的细胞凋亡可能激活Caspase-3的凋亡活性而抑制Survivin的抗凋亡过程。本实验NDV瘤内注射诱导凋亡抑制瘤细胞生长，调动机体抗肿瘤的免疫功能，NDV为治疗卵巢癌提供新思路。
NDV通过激活Caspase-3凋亡作用，抑制Survivin抗调亡，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制其生长。新城疫病毒（NDV）有可能成为卵巢癌生物治疗的有效药物，Survivin、Caspase-3可能成为疗效指标之一。
[参考文献]
[1] Mayo MA. A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV[J]. Arch Virol， 2002， 147（8）： 1655-1663.
[2] Subbiah E， Daniel R， Siba KS， et al. Newcastle Disease Virus exerts oncolysis by both intrinsic and extrinsic caspase-dependent pathways of cell death[J]. J Virol， 2006，80（15）： 7522�7534.
[3] Vigil A， Park MS， García-Sastre A， et al. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus[J]. Cancer Res， 2007， 67（17）： 8285�8292.
[4]卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M]. 第 2 版.北京：高等教育出版社， 2001： 111-114.
（收稿日期：2010-08-18）
