【www.zhangdahai.com--学校工作计划】
【摘要】目的RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是发生在mRNA水平上的一种基因沉寂现象，即在外源性双链RNA导入细胞后可以引起细胞内与其同源的mRNA特异性降解，使该基因在RNA水平上被关闭而导致其不表达，即转录后基因沉寂。小干扰RNA（smallinterferringRNA,siRNA）已经发展成为研究基因功能的有效工具，具有相当高的特异性；可以高效、特异地阻断体内同源基因的表达,促进同源mRNA降解。而表皮生长因子能诱导成纤维细胞的移动，促进EGF受体激活与推动力产生的分子链接，构成完整的信号传递链，从而使EGF信号完成传递，最终引发一系列的细胞生化反应。�
【关键词】RNAi;EGF;siRNAs;EGFR
RNA干扰是上个世纪兴起并发展起来的一种技术，但因其在基因功能研究中的巨大优势和潜力使得其迅速发展，同时其研究也不断深入。RNAi沉默机制主要表现在抗病毒、基因调控、染色质浓缩、转座子沉默、基因组重组等领域，它主要用于高通量的基因功能研究、基因敲除、基因治疗及药物筛选方面［1］。越来越多的科学工作者把它引入到表皮生长因子（epidermalgrowthfactor,简称EGF）及表皮生长因子受体（EGFreceptor，简称EGFR）的功能研究中。因为此效应机制中存在众多的功能蛋白质，利用RNAi技术对其编码基因进行阻遏，用这一突变型与原野生型比照，便可分析得出此蛋白在整个效应机制中的作用，而且结果很具说服力，因为此种技术本身就很可靠，它是从基因的角度进行操作，排除了在转录翻译过程中容易出现的干扰因素，所以RNAi在研究EGF的效应机制中很具有研究价值且应用前景十分广泛。�
1RNAi的作用机理研究�
RNA作为核酸，它本身不具有蛋白酶类的任何功能，但它却能在胞内引发如此大的功能变化，其过程相当复杂。目前对其研究已很清楚，dsRNA(doublestrandRNA,>19bp)是RNAi的效应源，其进入细胞后激活胞内自然存在的加工活性，引起对侵入的外源dsRNA具有同源序列的单链RNA降解（包括内源性的mRNA）［2］。研究表明dsRNA开导的同源靶mRNA的RNAi分三步进行［5］：首先，细胞内RnaseⅢ样核酸内切酶（Dicer酶）在ATP供能条件下将长的双链RNA(dsRNA)切割加工成21-25nt的正义和反义链组成的小片段双链RNA-小干扰RNA（smallinterferingRNA,siRNA）;然后siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋为两条单链，接着在其反义链的指导下形成由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成的RNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），活化后的RISC在单链siRNA引导下特异性识别并互补结合同源mRNA序列，进一步将之切割；最后被切割成片段的mRNA再被核酸外切酶进一步降解,从而在翻译水平干扰基因表达。但表皮生长因子的信号传递过程的具体效应机制目前尚不十分清楚。本文总结国内外此研究领域使用RNAi技术来探究EGF及表皮生长因子受体效应机制的方法，为其更深入的研究提供参考。�
2EGF及EGFR的发现及性质研究�
2.1EGF与EGFR的发现及结构性质EGF是Cohen在1962年从鼠颌下腺分离出的一种具有神经生长活性的成分，由53个氨基酸组成，其对酸热比较稳定，能抵抗胰蛋白酶、糜蛋白酶的消化［3］。EGFR是一分子量为170000的跨膜糖蛋白，主要通过Ras/MAPK系统、P13K/AKT系统和�PLC/PKC�系统实现信号转导的级联放大效应，将有丝分裂信号从细胞外传递到细胞内，调节正常细胞的生长、分化、调控细胞周期，促进损伤修复。EGFR过度表达不仅可导致细胞异常增生、存活，黏附迁移和分化，而且与损伤修复关系密切。�
EGFR最初是从人的磷状癌细胞株（A431）中分离出来的，编码EGFR的核酸序列位于第7条染色体上，其初步编码的EGFR为单链跨膜蛋白，含1186-1210个氨基酸残基，分子量134-135KD，该肽链片段在第11-12个天门冬氨酸残基部进一部糖基化后，分子量增加至170KD，即为成熟的EGFR［3］。�
2.2EGFR激活过程当EGF与其受体结合后，导致受体聚合（酪氨酸激酶被激活所必需因素之一）并加强受体C末端至少3个酪氨酸残基（丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸）的自身磷酸化，酪氨酸激酶的磷酸化可使胞内磷脂酶C-γ（PLC-γ）和微管相关蛋白（MAP）激活，后者的激活可引发胞内GTPase激活蛋白（GAP）磷脂酶-C和脂肪皮质素等胞内底物磷酸化，引起级联反应，导致许多重要的核蛋白磷酸化，从而发挥EGF的生物学作用。�
3RNAi在EGF研究中的应用�
3.1EGFR和Src酪氨酸激酶协作调控EGFR介导的细胞信号转导和促进细胞迁移和癌变，Src的激活由Csk(C-terminalSrckinase)严格控制，而Csk结合蛋白（Csk-bindingprotein,Cbp）是一种普遍表达的跨膜蛋白，它可以通过结合Csk和阻遏Src家族激酶（SFK）来抑制T细胞受体活化。而且EGF激活诱导的Cbp酪氨酸磷酸化伴随着Cbp-Csk的结合，并单独以SFK的方式。野生型表达的Cbp抑制EGF诱导的激活（包括Src,ERK1/2,Akt-1酶类，以及NIH373细胞的转化）。通过RNAi降低NTH373细胞内内源Cbp的表达明显增强了EGF诱导激活的效应［4］。�
3.2当对RTKs(receptortyrosinekinases)缺少负信号传递时可导致癌化反应，在乳腺癌细胞中存在转录调控的ErbBRTKs反馈抑制剂RALT/MIG-6，它可抑制肿瘤。当使用RNAi降低RALT的表达时，可增强正常表皮细胞EGF依赖和增殖［5］。�
3.3在抑制非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株A549细胞表皮生长因子受体表达的实验中，用体外化学合成的EGFR序列特异性双链RNA（dsRNA）进行RNAi，用lipofectamine2000转染A549细胞，采用Westernblot和流式细胞仪检测EGFR的表达，并观察A549细胞周期、集落形成、化疗敏感性等生物学特性的改变，结果dsRNA-EGFR可有效抑制A549细胞EGFR的表达，并将更多的细胞阻滞在G0-G1期，抑制细胞增生［6］。�
3.4为了鉴定EGFR胞吞作用的参与蛋白，在Hela细胞内使用siRNA敲除13种此类功能蛋白的表达，通过比照分析得出它能阻遏受体的内倾化，明显表现的有EGF的降低比率达40%-60%，对其附属物表达的降低对于细胞内吞作用没有影响，但明显抑制EGF［7］。�
3.5相关报道称刺激性G蛋白亚单位-Galphas促进EFGR和TexasRedEGF的配位体独立降解［8］。当使用RNAi拆除Galphas的表达时延迟了受体的降解，而且利用双-RNAi同时拆除Hrs和Galphas的表达时，对EGFRde降解所起的阻遏作用明显强于分别拆除时的效应。用此方法证明了Galphas和Hrs在调节EGFR降解过程中协同作用。�
3.6Gene33(aadapterprotein)的功能已知G33调节EGFR的信号传递，发现它抑制EGFR的自动磷酸化以及专一性的使EGF诱导的活化受阻。使用RNA干扰来介导它的沉默时明显有EGF诱导的蛋白质和DNA合成。它表明Gene33是EGFR磷酸
化的反馈抑制剂，功能表现在抑制EGFR的磷酸化和所有EGFR激活诱导的反应［9］。�
4结论与展望�
使用RNAi技术对EGF及EGFR进行研究，将拆除蛋白的表达的细胞与内源表达此蛋白的细胞做比较，了解此蛋白的功能效应，实验方法技术直观，结果便于后续分析且具有说服力，这也是RNAi能得到如此大的发展和运用的原因所在。�
EGF诱导的EGFR反应是一个后续效应非常复杂的反应链机制，其内的许多作用机理与效应物间的诱导效应并不十分清楚，RNAi技术进行研究将会获得显著突破，从而了解此过程，再利用上游工程技术对其性质特点进行研究，可以了解抑制细胞癌化，促进细胞正常生长增殖及分化的药物，解决目前尚不能治疗的病患，此前景非常广阔。
本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
