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【摘要】 目的 建立海狗三鞭丸中淫羊藿苷含量测定方法。方法 采用HPLC法进行测定研究,色谱条件:采用Agilent Hypersil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)柱,以乙睛-水液(25:75)为流动相,检测波长270 nm,流速1.0 ml/min。结果 HPLC法测定结果显示,色谱峰形好,分离度好,杂质无干扰,淫羊藿苷在0.200~2.00 μg内呈现良好的线性关系,平均加样回收率为98.16%(RSD=1.12%),回归方程为y=2083.1x+12.775,r=0.9998。结论 该方法分离度高、专属性强、重现好,可有效用于海狗三鞭丸中淫羊藿苷的含量测定。
【关键词】
海狗三鞭丸;淫羊藿苷;高效液相色谱法;含量
Determination of Icariin in Haigou Sanbian Pill by HPLCLIANG Yu-hua,GUO Xue-ting.Central Hospital of Panyu District,Guangdong,Guangzhou 511400,China
【Abstract】 Objective To establish a method to determine the content of icariin in haigou sanbian pill.Methods The HPLC was applied with the condition as follows:column:Agilent Hypersil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);mobile phase:ACN-water(25:75);detection wavelength:270 nm;flow speed:1.0 ml/min.Results The HPLC analysis results showed that icariin had a good peak profile and separating degree without impurities.The calibration curves for icariin was linear within the range of 0.200~2.00 μg with its average sample adding rate of recovery 98.16%(RSD=1.12%).The regression equation was y=2083.1x+12.775,r=0.9998.Conclusion The method has a good resolution,strong specificity and good reproducibility for determining and can be used to control the content of icariin in haigou sanbian pill.
【Key words】
Haigou Sanbian Pill;Icariin;HPLC;Content
海狗三鞭丸由海狗鞭、北鹿鞭、山羊鞭、淫羊藿、巴戟天、枸杞子等二十多味药材经现代科技精制提炼而成,具有补肾壮阳、强筋健骨、益精补血等作用,用于肾阳虚引起的腰膝酸软、神疲乏力、肢体困倦、怕冷、夜尿频多、气短作喘;对肾气虚弱、阳痿早泄、性欲衰退有改善作用。淫羊藿为其方中君药之一,其所含主要有效成分为淫羊藿苷(Icariin)[1-4],目前尚未建立海狗三鞭丸中淫羊藿苷的含量测定方法。为了更好的控制该产品质量,保证用药的有效稳定可控,本文采用高效液相色谱技术建立淫羊藿苷的含量测定方法,有利于该产品的质量评价。结果表明,该方法具有测定快速、准确、重现性好等特点,可用于该制剂淫羊藿苷的含量测定。
1 仪器与试药
Agilent1100高压液相色谱仪系列(美国),Sartorius BP211D电子分析天平(德国),电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂),超声清洗器(北京医疗设备二厂),淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所110737-200312),乙腈为色谱纯,甲醇等其它试剂均为分析纯,水为三蒸水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 固定相:Agilent Hypersil C18(4.6 mm*250 mm,5 μm);流动相:乙睛-水(25:75);检测波长为270nm。流速为1.0 ml/min。运行时间20 min。
2.2 试验样品的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 取对照品淫羊藿苷适量,精密称定,置10 ml容量瓶中,加甲醇超声溶解后,再用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得(每1 ml中含淫羊藿苷200 μg)。测定前用微孔滤膜滤过,取续滤液备用。
2.2.2 供试品溶液制备 取本品适量,碾碎,取2.5 g,精密称定,置具塞量瓶中,加甲醇20 ml,称重,加塞,超声提取45 min(时时振摇),取出,放冷,称重,补足损失部分,摇匀,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
2.2.3 阴性样品制备 去除淫羊藿药材,按处方用量和制备方法制备成缺淫羊藿阴性样品,称取该样品适量,按供试品制备方法制备成缺淫羊藿阴性对照溶液。
2.3 系统适应性试验 分别精密吸取2.2.1、2.2.2、2.2.3项下溶液,按2.1项下色谱条件进样,记录色谱图(见图1)。由图1可见,在该色谱条件下,淫羊藿苷与其它成分可达基线分离,阴性对照图谱中在对照品色谱峰位置上未见其它成分对测定有干扰。其中淫羊藿苷色谱峰的保留时间约为13.2 min,理论塔板数达到2500以上,与其它成分的分离度均>1.5,对照品色谱峰与供试品色谱中相对应色谱峰的紫外光谱吸收均一致,表明在上述色谱条件下对淫羊藿苷具有良好的分离效果。
2.4 方法学验证
2.4.1 标准曲线的建立 本研究采用外标法进行测定。分别精密吸取对照品溶液1、2、5、8、10 μl注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件进行测定,以进样量(X,μg)对峰面积(Y,A)进行线性回归,建立标准曲线。结果显示,淫羊藿苷进样量在0.200~2.00 μg范围呈良好的线性,回归方程为y=2083.1x+12.775,相关系数r=0.9998。
2.4.2 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μl,按上述色谱条件进行测定,重复6次,测得淫羊藿苷的峰面积平均值为1176.93,RSD为0.13%(n=6),表明仪器精密度良好。
2.4.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μl,分别间隔0、2、3、4、6、28 h,按上述色谱条件进样测定,测定淫羊藿苷峰面积平均值为1 180.55,RSD为0.50%(n=6),表明样品在室温下放置28 h内稳定。
2.4.4 重复性试验 称取同一批样品,碾碎,精密称定,按照2.2.2项下方法制备6份供试品溶液,分别精密吸取供试品溶液各10 μl按照上述测定条件进行测定,结果显示,淫羊藿苷含量平均值为0.4 525 mg/μg,RSD为1.8%(n=6),表明该方法的重复性好,方法可行。
2.4.5 回收率试验 取已知含量的样品粉末约1.5 g,共6份,每组 2 份,按高、中、低3种浓度分别加入适量对照品溶液,再按供试品溶液制备方法制备样品溶液,在上述色谱条件下测定含量,计算回收率。结果见表1。
2.5 样品测定和结果 按2.2.2项下方法分别制备供试品溶液,分别精密供试品溶液各10 μl,按上述拟定的色谱条件测定,每个样品平行测定2次,外标法计算含量。结果见表2。
3 讨论
海狗三鞭丸是由二十多味中药精制而成。淫羊藿为其君药之一,据《本草纲目》记载,具有“益精气,坚筋骨,补腰膝,强心力”等功效,现代医学研究表明,其主要化学成分为黄酮类化合物,其中以淫羊藿苷 [1]为代表成分,淫羊藿苷[4]能拮抗丙基硫氧嘧啶的甲状腺抑制作用,预防“肾阳虚”证的出现,又能促进丙基硫氧嘧啶所致甲减“肾阳虚”小鼠体内甲状腺激素水平的提高,具有补肾壮阳的作用,还能明显增加脑血流量,降低脑血管阻力,对脑缺氧有保护作用,此外还具有 “健骨”、预防和治疗心血管疾病发生、抗肿瘤等作用。因此,本研究选择淫羊藿苷作为该制剂的主要评价指标,并对其进行了含量测定,具有一定的代表性。
供试品溶液制备方面,在提取溶剂(甲醇、乙醇、50%甲醇)、提取方式(超声、回流)和提取时间(15、30、45、60 min)等方面进行了考察,结果表明,以甲醇提取所得溶液相对优于乙醇和50%甲醇,采用超声提取速率优于回流法,且有利于溶剂的穿透和样品振散,提取时间在30 min后淫羊藿苷提取率基本稳定,故供试品制备以甲醇为溶剂采用超声法进行提取,提取时间稍延长至45 min。由于该制剂为大蜜丸,故在供试品制备前要先将样品细心捣碎,提取过程中要时时振摇,有利于药粉分散,提高提取率。
本研究还比较了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水等流动相,以乙腈-水的分析效果较优,分离度较高,基线平稳。
本文所建立方法经验证具有良好的精密度、准确度、重复性和专属性,能够有效用于测定淫羊藿苷含量和海狗三鞭丸的质量评价。
参 考 文 献
[1] 中国药典(2005年版一部),2005:229-453.
[2] 黄评贵,喻定开,孙树山,等.HPLC测定抗骨增生口服液中淫羊藿苷的含量.中成药,2003,25(9):774-775.
[3] 彭艳,王苑桃.HPLC测定三宝双喜膏中淫羊藿苷的含量.中成药,2001,23(12):925-9261.
[4] 欧明,林励,李衍文,等.简明中药成分手册.中国医药科技出版社,2003:363-366.
