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文章编号：1009-5519(2008)08-1221-02 中图分类号：R446 文献标识码：B 支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的污染物，约有30.3％～50.5％的细胞培养物中有支原体污染。培养细胞中支原体污染的来源包括：所使用的动物来源的一些产品如血清或已被支原体污染的细胞株系。细胞培养上清液中支原体的浓度可达107个/ml，而培养的细胞看起来很正常，在肉眼观察或普通光学显微镜下观察，受污染的细胞可无明显变化。由于竞争营养及支原体有毒的代谢产物，支原体污染可显著影响培养细胞的生理活性，使研究结果的真实性和可靠性大大下降。本实验拟使用4种方案处理体外培养的支原体污染贴壁细胞，并就其疗效进行比较，现报道如下。
1 材料
1．1 试剂及动物：(高糖)DMEM培养基：Giboco；胰蛋白酶：Gi-boco；DNA荧光法染色检测支原体试剂盒：Epitomics；BM-Cy-din：Roche；Bab/c裸鼠：北京动物所。
1．2 细胞的来源和培养：人乳腺癌MCF-7细胞株，购自四川大学华西医学中心分子遗传学研究室。体外于不加抗生素的内含10％小牛血清的DMEM培养基，37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
2 方法
实验分为试验组、阳性对照组和阴性对照组。试验组为支原体污染且用不同方法作用的细胞，阳性对照组为支原体污染常规培养未作特殊处理的细胞，阴性对照组为常规培养支原体未污染的正常细胞。
2．1 支原体污染检测：被检细胞接种在无菌的6孔细胞培养板中，接种密度为2×10O4/ml。5天后，先吸去培养液，再加入1ml的固定液，静置20min，吸去固定液，风干10min。于每孔中，加入lml的Hoechst33258工作液，37℃，20min。吸去Hoechst 33258工作液，风干后加入1滴封固液，并以盖玻片覆盖。用400x荧光显微镜观察细胞。
2．2 支原体污染清除：试验组细胞按5×104/ml密度接种于25ml培养瓶内。利用各种方法作用后，检测支原体污染情况。阴性对照组及阳性对照组用不加抗生素的含10％小牛血清的DMEM培养基在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
2．2．1 加温法：试验组细胞放入41℃温箱内，分别在8h、12h、16h、24h及48h末进行支原体的检测。
2．2．2 多西环素、环丙沙星联合排除法：多西环素和环丙沙星联合用药，试验组分为3组，两种药物用量分别为30μg/ml，50μg/ml和100μg/ml，培养24h、36h、48h末进行支原体的检测。
2．2．3 BM-Cyclin-1、2排除法：细胞传代同时加BM-Cychn-l10μg/ml，37℃培养3天；胰蛋白酶消化、传代，加入BM-Cyclin-25μg/ml，37℃培养3天；继续传代追加BM-Cychn-2 5μg/ml次，培养2～4天弃药液，D-Hank"s液洗2次，胰蛋白酶消化传代，进行常规培养。
2．2．4 裸鼠过继法去除支原体闯：将支原体污染的细胞用0，25％胰酶，0.02％EDTA消化制成单细胞悬液后用PBS洗涤离心2次，调细胞密度至107个/ml；经小鼠背部皮下接种0.2ml细胞约10～15天后即可形成移植瘤；3～4周后无菌条件下取出移植瘤组织，剔除坏死部分，用注射器针芯在200目筛下将组织压碎使细胞释放人含0.1％EDTA的无血清DMEM培养液中：将细胞悬液小心加入含有淋巴细胞分离液离心管上层，室温下水平离心3000r/min，20min；用吸管吸出两种液体界面层的细胞置无血清DMEM培养液中，计数细胞；于无血清DMEM将细胞洗涤离心1次，用完全培养液调细胞密度至5×105个/ml，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
3 结果
3．1 阴性对照组和阳性对照组：阴性对照组细胞经Hoechst33258荧光染色后，仅细胞核显色，细胞表面及细胞周围干净、清晰，无荧光小点。阳性对照组经Hoechst33258荧光染色后，可见细胞核与细胞膜及其周围均可见散在的蓝色荧光颗粒，其密集程度与污染呈正相关。
3．2 加温对支原体污染的治疗效果：经观察发现，加温8h后，荧光小点开始变少。16h细胞周围支原体几乎消失。进入24h开始细胞周围的荧光小点完全消失，但细胞开始逐渐变圆。脱落飞48h大部分细胞已完全变圆，细胞正常形态消失，培养基中出现飘浮死亡细胞。
3．3 多西环素、环丙沙星联合治疗支原体的效果：30μg/ml组和50μg/ml组多西环素和环丙沙星作用细胞24h开始，荧光开始减少，36h仅见少量荧光，48h荧光完全消失。细胞未见明显变形脱落、死亡。100μg/ml组的多西环素和环丙沙星联合作用24h荧光完全消失，至36h细胞无明显变形死亡，但48h开始出现细胞变圆，脱落，生长变慢。
3．4 BM-Cyclin-1、2排除法：按以上方法处理后，经Hoechst33258荧光染色后，细胞表面及细胞周围干净清晰，无荧光小点。细胞无明显脱落、变形死亡。
3．5 裸鼠过继法处理细胞后常规培养，经Hoechst33258荧光染色后，未见支原体感染。细胞分裂生长旺盛。
4 讨论
支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5μm之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。支原体约有1％可通过滤菌器，用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性，因此在普通光学显微镜下不易被发现。在电子显微镜下可见支原体多吸附或散在于细胞之间，断面与细胞徽绒毛相似。支原体感染发生后能改变细胞的DNA、RNA及蛋白表达，对细胞的生理活动产生多方面的影响。由于支原体无细胞壁，所以通常作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐药。本试验用4种方法对支原体污染的体外培养贴壁细胞MCF-7进行救治，现就其疗效进行比较。见表1。
另外，目前市场上有新一代支原体抗生素M-Plasmocin(In-vitroGen公司)，其含有两种杀菌成分，一种成分通过干扰核糖体的翻译功能而使蛋白合成受阻。另一种成分则通过干扰复制叉的形成而阻止DNA的复制。由于这两种成分的靶分子只存在于支原体和许多其它细菌中而并不存在于真核细胞中，所以可以强效对抗支原体及相关的无胞壁的细菌，同时又不影响细胞本身的代谢，且处理过的细胞不会重新感染支原体，是目前对抗支原体最理想的方法。但是该种药物价格非常昂贵，限制了其广泛应用。
在细胞培养工作中可采用以下几点来控制支原体的污染问题：(1)预防为主：细胞培养实验室应制定严格的管理制度，按照规范的实验程序操作。(2)从可靠来源引进、使用细胞，特别是知名的信誉，良好的专门机构，如ATCC、基础医学细胞中心等，这些机构对细胞质量进行一系列检测。(3)定期对实验室中的培养物进行支原体检测。一旦发现已经污染支原体的培养物，要避免支原体的进一步播散，如细胞株易获得，灭活后弃之，更换新的培养物；如细胞株珍贵，有效方法救治后检测确无支原体污染后继续使用。随着新技术的发展，细胞污染支原体的检测和清除研究将获得重大进展。
