【www.zhangdahai.com--开题报告】
志贺菌属是一类革兰阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。副溶血性弧菌是一种嗜盐弧菌，为食物中毒中常见的一种革兰阴性弧菌。检测这2种细菌，传统的方法主要依赖培养，耗时长，一般需3~7 d[1]。�
随着医学分子微生物学的不断发展，近几年研制出的单一聚合酶链反应(PCR)技术检测病原体的方法，已在许多临床实验室中开展，并显示出了较突出的优点，但仍摆脱不了检测1种病原菌，需要1种器皿的模式，还达不到简单的目的。为此，我们在研究单一PCR方法的基础上，又建立了多重PCR快速检测志贺菌和副溶血性弧菌的新方法，在同一反应管内，用两对不同的引物同时检测2种病原菌的存在[2]。��
1材料与方法�
1.1菌种�
志贺菌不同血清型菌株10株，副溶血性弧菌10株，由上海市疾病预防控制中心提供部分标准菌株，其余均为本实验室鉴定保存菌种。�
1.2仪器�Techne Flexigene PCR扩增仪; Tanon GIS-2010全自动数码凝胶成像系统 。�
1. 3引物设计�
检测志贺菌的引物:�
上游:5’ tcc gga gat tgt tcc atg tg3’;下游:5’ tgt atc aca gat atg gca tgc 3’。 �
检测副溶血性弧菌的引物:�
上游: 5’ att ctg ctg tgt tcg taa aat 3’;下游: 5’ cca agt aaa atg tat ttg gat g 3’。�
所有引物及试剂均由上海第二医科大学天能科技有限公司合成和提供。�
1. 4PCR模板制备�
参照文献[2]，取3~4个菌落，悬于100 μL蒸馏水中，95℃水浴15 min，放冰浴冷却，再10 000 r/min离心20 s，取上清液(DNA含量约30~50 ng/μL)放-20℃备用。�
1. 5PCR反应�
采用标准PCR反应液的配制方法[3]，我们将各引物对分别配成单一PCR系统。在使用TaKaRa LA Taq酶(DRR02AM)时，加入10×LA PCR Buffer(Mg2+ free)5 μL， dNTP Mixture (各2.5 mM)8 μL，MgCl2(25 mM)5 μL。 Primer 1:0.2~1.0 μM， primer 2:0.2~1.0 μM， TaKaRa LA Taq酶(5 U/L)0.5 μL，加灭菌蒸馏水定容至50 μL。 PCR反应条件为:94℃预变性5 min，94℃40 s，55℃35 s，72℃90 s循环35次，72℃延长3 min。经Agarose凝胶电泳紫外灯下观察结果。
1. 6特异性试验�
从两组单一PCR系统中各取出不同量反应液按一定比例混合后加入志贺菌､副溶血性弧菌､鼠伤寒沙门菌､大肠埃希菌的DNA模板，制成总量50 μL体系的多种组合，进行多重PCR扩增。�
1. 7敏感度试验�利用目测比浊法将志贺菌和副溶血性弧菌在108处开始作10倍递减稀释，从10-1~10-8稀释度中各取1 mL作PCR扩增。并同时作平板菌落计数。�
1.8引物的浓度配伍�
将两对引物配制成几组不同的浓度，志贺菌引物∶副溶血性弧菌引物为1∶1､1.5∶1､3∶1､4∶1､1∶1.5､1∶3､1∶4。在相同的反应条件下，先用单一PCR扩增体系扩增出阳性标本，然后用上述几组不同浓度比的多重PCR引物体系进行扩增，选出引物最佳浓度配伍。��
2结果�
2. 1引物特异性和敏感度�
各对引物只与对应的菌种发生阳性扩增，志贺菌阳性条带为420 bp，副溶血性弧菌阳性条带为290 bp，与其他菌株均未出现特征性阳性条带(图1)。�
引物的敏感度实验结果，志贺菌和副溶血性弧菌引物均可检测到10~20 cfu/mL菌量水平。��
1. Marker(100 bp); 2. 志贺菌+副溶血性弧菌; 3. 志贺菌+副溶血性弧菌+鼠伤寒沙门菌+大肠埃希菌;
4. 志贺菌+鼠伤寒沙门菌+大肠埃希菌; 5. 副溶血性弧菌+鼠伤寒沙门菌+大肠埃希菌�
图1引物的特异性
2.2引物的浓度配伍 �
在本实验室条件下，引物志贺菌∶副溶血性弧菌浓度比为�3∶1。�
2. 3 常规培养法､单一PCR与多重PCR检测实际样品的比较�
对采集的336份食物中毒事件样品检测副溶血性弧菌，其阳性检出率为31.25%~35.41%。�
常规法和单一PCR法､复合PCR法检测副溶血性弧菌的阳性符合率均为88.24%。单一PCR法和多重PCR法的阳性符合率为100.00%(表1)。��
对医院肠道门诊采集的220份肛拭样品检测志贺菌，其阳性检出率为19.55%~23.18%。�
常规法和单一PCR法､多重PCR法检测志贺菌的阳性符合率分别为�84.31%､86.00%。单一PCR法和多重PCR法的阳性符合率为98.04%(表2)。��
3讨论�
根据检测目的的不同，引物设计的基因位点不同，在同一基因上设计选择不同对的引物其敏感度可相差10~1 000倍[4]。实践证明，只有在选择的单一PCR引物较完美的情况下，才能考虑多重PCR的配伍。这种配伍在目前还没有什么规律，因为几种单一PCR好用的引物，组成复合体系后会因引物间的相互作用而影响结果，只能通过实践的反复检验来筛选。鉴于此，本实验室与试剂提供商密切合作，在多重PCR引物的特异性和敏感性上下了一番功夫。我们采用先制成单一PCR系统测试其可靠性后[5]，再制成多重PCR系统的方式，在实际的操作中证明了多重PCR系统中两引物对的可靠性，结果是令人满意的。�
在本次实验过程中，祛除DNA模板中混有的蛋白质､脂肪､杂离子(离子表面活性剂)等影响和抑制PCR扩增及Taq酶活性的抑制因子非常重要。实验发现，利用70%乙醇反复洗涤沉淀物就能较好地实现祛除抑制因子，有效提高模板DNA扩增的产量的目的。�
优化各种条件后，我们对220份肛拭样本和336份食物中毒事件标本，用常规法､单一PCR和多重PCR法同时检测，发现单一PCR和多重PCR法阳性检出率高于常规法，且单一PCR和多重PCR法在检测志贺菌和副溶血性弧菌时阳性符合率分别达到 98.04%和100.00%。�
实验证明了该多重PCR系统具有一定的临床应用价值。��
4参考文献�
[1]GB/T4789.1―2003， 食品卫生微生物学检验总则[S]. �
[2]苏明权，于文彬， 马越云，等.多重聚合酶链反应快速检测脑膜炎中的病原体[J].第四军医大学学报，2000，21(4):405-407.�
[3]Grundmann HJ， Towner KJ，Dijkshoorn L， et al. Multicenter study using standardized protocols and reagents for evaluation of reproducibility of PCR-based fingerprintiong of Acinetobacter spp[J]. J Clin Microbiol， 1997， 35:3071-3077.�
[4]Wang L， Fliegel C，Cass E， et al. Primers are decisive for sensitivity of PCR[J]. Biotechniques， 1994， 17: 82.�
[5]谢晓红，韩华忠，沈莉，等.用PCR快速检测食物中毒病原菌的方法研究[J].中国卫生检验杂志， 2003， 13( 3):280-282.
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(收稿日期:2006-04-10)[HT][HJ]�
