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【摘要】 目的 探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法 根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因，克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中，重组载体线性化后，转化毕赤酵母GS115，甲醇诱导表达。应用 DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物，采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果 葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%；表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%；测得其比活为5．2×10�4AU/mg。结论 利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。�
【关键词】葡激酶；毕赤酵母；表达和纯化
Expression and purification of staphylokinase in Pichia pastoris
SONG Lei，LIU Hong-jun，LIU ning.Shandong Quangang Pharmaceutical Limited Company,Jinan,250014
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【Abstract】 Objective To study the expression staphylokinase gene in Pichia pastoris and the purification of expression product .Methods An artificial gene for staphylokinase was synthesized by using favored codons of the yeast Pichia pastoris.The gene was cloned into the secretory expression vector pPIC9K,and the recombinant vector was linearized and transformed into GS115,transformants had expression after inducement with methanol.The recombinant protein was purified through the steps of DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200,and bioactivity was analyzed.Results The expression of staphylokinase in Pichia pastoris came up to 45%of total proteins;The recombinant protein was further purified by DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200 to the 95%purity;purified was more than 5．2×10�4AU/mg.Conclusion Staphylokinasehas been expressed in Pichia pastoris and purified successfully�
【Key words】Staphylokinase;Pichia pastoris；Expression and purification
葡激酶(SAK)是金黄色葡萄球菌产生的一种胞外激酶，能特异地激活血浆纤溶酶系统溶解血栓。在此作用过程中，血浆纤维蛋白原浓度几乎不受影响，加之分子量小，有较强地穿透性，对富含血小板地血栓，尤其是脑动脉血栓和肢体静脉血栓地溶解较目前使用的链激酶和组织型纤溶酶原激活剂，具有溶栓速度快、毒副反应小和成本较低等特点，因而临床应用前景十分广阔[1-2]。目前，大肠杆菌表达的葡激酶已在国内上市，但存在产量低、不易纯化等问题。笔者使用的毕赤酵母是一种新型外源基因表达系统，具有许多明显优点，其诱导分泌表达的启动子AOX1可用甲醇严格调控，表达产物分泌到上清，不需要复杂的破菌手段。而且表达上清的杂蛋白含量很低，有利于进一步的分离纯化，是理想的表达系统[3]。
1 材料和方法
1．1 基因、菌种、载体 葡激酶基因由大连宝生物合成；大肠杆菌DH5α为本单位保存；酵母穿梭表达载体pPIC9K，Pichia Pastoris表达菌GS115(His-mut+),购自Invitrogen公司。
1．2 酶及其他试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、G418低熔点琼脂糖为大连宝生物产品；柱层析填料DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF、S-200购自购自Amersham Pharmacia公司；重组葡激酶活性测定国家标准品(1000IU/支)购自中国生物制品检定所；其他试剂均为分析纯。
1．3 培养基 MD(13．4 g/L YNB,4×1-4 g/L生物素，20 g/L葡萄糖，15 g/L琼脂粉)；MM(13．4 g/L YNB,4×1-4 g/L生物素,2%甲醇，15 g/L琼脂粉)；BMGY(10 g/L酵母膏，20 g/L蛋白胨，0．1 mmol/L磷酸钾缓冲液，pH6．0,13．4 g/L YNB,4×1-4 g/L生物素,1%甘油)；BMMY(将BMGY中1%甘油用2%甲醇替代)。
2 方法
2．1 葡激酶cDNA的设计和人工合成 根据专利报道[4]的葡激酶的基因序列,选用酵母偏爱密码子,人工合成葡激酶基因。
2．2 重组质粒的构建 合成的目的基因经XhoⅠ和EcoRⅠ内切酶消化后，与经同样内切酶处理的pPIC9K在T4连接酶的作用下连接形成pPIC9K-SaK，转染感受态的大肠杆菌DH5а，氨苄青霉平板挑取单克隆，提取质粒进行酶切鉴定。质粒抽提、酶切反应、DNA片断回收、连接反应、细菌转化等技术见精编分子生物学实验指南的方法进行[5]。
2．3 酵母菌GS115的转化 提取约20 ug测序正确的pPIC9K-SaK质粒，用SalⅠ线性化后，用Bio-Rad gene pulse在1 500 V 20 Uf,200的条件下电击转入GS115酵母感受态中，涂于不含His的MD平板上,30℃培养2~3 d，观察转化子的生长。
2．4 多拷贝整合转化子的筛选 将MD平板上生长的His�+转化子从培养基上刮下来，分别涂在逐步增高G418浓度(依次1、2、3、4 mg/L)的YPD平板上(10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、15 g/L琼脂)，逐级筛选高拷贝插入的阳性菌落，挑取G418上生长的阳性菌落。上述操作参照Invitrogen 公司 Multicopy Pichia exptression kit manual说明书进行。
2．5 诱导表达及SDS-PAGE电泳分析 挑取重组体单菌落接种于BMGY培养基中，30℃震荡培养过夜，A��600�约为5．0，离心收集菌体，以BMMY培养基重悬菌体至，A��600�为2．0后诱导表达，每隔24 h补加甲醇至终浓度1%，在0、24、36、72，等时间点各取1 ml发酵液，离心收集上清，12%的SDS-PAGE凝胶检测重组蛋白表达结果。
2．6 表达产物的纯化制备
2．6．1 超滤浓缩脱盐 将发酵离心所获的上清，经Millipore超滤装置浓缩，脱去无机盐。
2．6．2 DEAE-Sepharose FF 用平衡缓冲液(20 mM Tris-Hcl pH8．0)充分平衡DEAE-Sepharose层析柱，将浓缩的蛋白以�2 ml/min�的流速上样，上样结束后以起始缓冲液洗出未结合的蛋白，然后进行线性梯度洗脱，洗脱梯度为含0→1 mol/l NaCl的平衡缓冲液。收集目的蛋白。
2．6．3 Q-Sepharose FF 用平衡缓冲液(20 mM Tris-Hcl pH8．0)充分平衡Q-Sepharose Fast Flow层析柱，将2．6．2步收集的目的蛋白对平衡缓冲液透析后进样，上样结束后以起始缓冲液洗出未结合的蛋白，然后进行线性梯度洗脱，洗脱梯度为含0→1 mol/l NaCl的平衡缓冲液，收集目的蛋白。
2．6．4 Sephacry1 S-200凝胶 用平衡缓冲液(20 mM NaAc-HAcpH5．00．3NaCl)充分平衡S-200层析柱，将盐析后的样品上柱，用平衡缓冲液，0．25 ml/min的流速洗脱，收集目的蛋白峰。样品以0．22 μm滤膜过滤除菌保存。
2．7 重组葡激酶纯度的检测 采用SDS-PAGE电泳分析各步的纯化产物；利用凝胶排阻HPLC法分析最终产品的纯度。
2．8 目的蛋白的含量测定 采用Lowry法(6)，用人血清白蛋白作为标准。
2．9 重组葡激酶生物学活性测定 采用溶圈法，125 mg琼脂糖用23 ml生理盐水溶解，60℃水浴保温，加凝血酶14 μl(125 IU/ml),纤溶酶原280 μl(0．5 g/L),摇匀，加2．2 ml人纤维蛋白原(6 g/L)，浑浊后倒平板(直径8 cm)，充分凝固后在形成的纤维蛋白平板内打孔(直径3 mm)，每孔(复孔)点样8 μl，25℃湿盒放置16 h。点样平板纵横2次量取溶圈直径，以各个稀释度的活性的对数为横坐标，以溶圈直径的平均数(4次量取的数值)的对数为纵坐标，采用生物统计软件分析结果。利用回归分析方法作标准曲线，并求得y=a+bx中的a和b及线性回归系数r值，根据样品的溶圈直径可求得样品的活性。在根据蛋白含量测定结果计算比活性。
3 结果
3．1 葡激酶酵母表达载体的构建 序列合成时在葡激酶基因引入5’XhoⅠ位点，在基因3’端引入EcoRⅠ位点。先将PCR产物克隆到穿梭载体pPIC9K中，转化大肠杆菌DH5а，氨苄青霉平板挑取单克隆，提取质粒用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定(结果见图1)，切出约408 bp目的基因；酶切结果和测序结果均于专利报道[4]的完全一致。�
3．2 多拷贝重组转化子筛选 用Sal I酶切线性化酵母表达载体质粒转入GS115，由于表达载体含有卡那霉素抗性基因。它能使酵母细胞对G418产生抗性。对G418抗性程度大致取决于卡那霉素抗性基因整合到酵母基因组中的数目。因此可以通过不同浓度的G418筛选来获得拷贝转化子。在4 g/L G418的MD平板上筛选到6个多拷贝转化子。
3．3 诱导表达及SDS-PAGE电泳分析 筛选到的高拷贝转化子进行BMGY/BMMY诱导表达，SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果(见图2)，酵母表达出分子量约16KD的蛋白质条带，且随这诱导时间的增加表达也增加,到72 h达到最大，表达量可达200 mg/L。�
3．4 表达产物的纯化和分析 酵母分泌表达产物利用超滤技术去除上清的大量无机盐和小分子杂质后，经过三步层析的方法，可以获得电泳纯度较高的样品(见图3)，纯化产物可达到95%以上，葡激酶得率可达50%~60%。�
3．5 生物学活性分析 以重组葡激酶活性测定国家标准品作标准曲线Y=6．81X-1．1299 Y=0．2718x+0．3554(r=0．996 2)。以样品平均溶圈直径的对数值代入，求得其生物学活性。测定最终纯化样品的蛋白含量，并通过计算得到样品比活为5．2×104AU/mg。
4 讨论�
酵母是近年发展起来的具有高效分泌表达的真核表达系统，可对目的蛋白进行翻译后修饰；该系统不含有特异性的病毒，不产生毒素；大规模发酵工艺简单，成本低廉。目前已有200多种重组蛋白在该系统中表达，不乏每升克级以上的表达量[7-8]。�
为了提高葡激酶表达量，对葡激酶基因进行了优化设计，选择酵母自己偏爱密码子，合成葡激酶的基因。利用已获得广泛认可的毕赤酵母表达系统，构建并且得到具有葡激酶基因的His�+Muts表型菌株，以甲醇为唯一碳源，对其进行诱导培养，实现了葡激酶的胞外表达。发酵液上清中葡激酶含量较高，产量为200 mg/L。�
本实验室所用构建的葡激酶工程菌表达水平高，发酵上清经超滤浓缩脱盐、DEAE-Sepharose等三步纯化后，纯度达到了95%以上，样品比活性达到了5．2×104AU/mg。建立的纯化工艺，色谱过程简便，成本低，蛋白回收率和活性值高。本公司研制的注射用重组葡激酶经过全面质控检验和药效学、毒理学和药代试验，各项指标均达到新药申报标准。本研究的纯化工艺的确定为葡激酶产品的大规模低成本制备奠定了基础。�
参考文献
［1］ Szarka SJ,Sihota EG,Habibi HR,et al.Staphylokinase as a plasminogen activator component in recombinant fusion proteins.Appl Environ Microbiol,1999,65(2)：506-513.
［2］ Wan M,Wang Y,Rabideau S,et al.An enzyme-linked immunosorbent assay for host cell protein contaminants in recombinant PEGylated staphylokinase mutant SYI61．J Pharm Biomed Anal,2002,28(5)：953-963.
［3］ Wang CM,Xie YH,Wang T.High efficient expression of recombinant human platelet factor Ⅳ in Pichia pastoris.Chin J Hematol,2001,22(3)：138-140.
［4］ 吴洽庆，杨卫华，李德华，等.一种制备葡激酶方法.中国专利，2006,10157156．6.
［5］ F奥斯伯，R.布伦特，R.E.仅斯顿,等.精编分子生物学实验指南.科学出版社，1999.
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［7］ Lin Cereghino GP,Sunga AJ,Lin Cereghino J,Cregg J M.Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris.Genet Eng(NY).2001,23：157-169.
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