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【摘要】 目的 提取人工培植雪莲中的总黄酮,并研究其抗炎作用。方法 采用醇提的方法获得雪莲总黄酮, 以硝酸铝作为显示剂,以芦丁为对照品,利用分光光度计测定其波长在510 nm处的吸光度值,测定其总黄酮的含量;采用角叉菜胶致足肿胀法和棉球致肉芽肿造成大鼠炎症动物模型,观察人工培植雪莲黄酮抗大鼠炎症的影响。结果 人工培植的雪莲总黄酮提取含量达3.59%,同时该黄酮对炎症早期出现的渗出、水肿有明显的抑制作用。结论 人工培植雪莲花的总黄酮对炎症大鼠模型有明显的抗炎症作用。
【关键词】 人工培植雪莲; 总黄酮; 抗炎症
Study of the effects of the ethanol extraction of cultured Saussurea on anti-inflammation
CHEN Wei-qiang,YANG Ze-min,HU Tai-ping, et al.
School of basic course, Guangdong pharmceutical university, Guangdong, Guangzhou 510006,China
【Abstract】 Objective To extract the total flavones from Cultured Saussurea , its anti-inflammatory effects is studied. Methods The total flavones are extracted by the ethyl alcohol immersion from saussurea. Using Rutin as control reagent and Aluminium nitrate as colorimetric reagent, and the absorbance in 510 nm wavelength is determined with spectrophotometer, by colorimetric method to determine the total contents of saussurea flavones. The rat inflammatory model is made by Carrageenan, the ethanol extraction of cultured Saussurea is studied on anti-inflammation.Results The alcohol extraction from Cultured Saussurea can significantly inhibit the early inflammatory exudation and edema.Conclusion The alcohol extraction from Cultured Saussurea have an obvious effect in anti-inflammatory reaction.
【Key words】 Culture of Saussurea;Total flavonoids;Anti-inflammatory
基金项目:广东省教育厅“育苗工程”基金资助项目
作者单位:510006广东药学院基础学院
雪莲是菊科风毛菊属(Saussurea D C)的一类,野生的雪莲主要生产于新疆天山、昆仑山,生长在雪线上,民间以全草入药,始见于藏药文献《月王药珍》,清代《本草纲目拾遗》也有记载,是西藏、新疆、青海、甘肃、云南、四川等高原寒带地区常用的民族药和民间药[1]。雪莲的药用化学成份是黄酮类、生物碱、内酯、甾醇、多糖及挥发油等多种成分;其主要次生代谢产物是黄酮及黄酮甙类化学合物。国内外研究表明雪莲黄酮具有抗炎镇痛、抗氧化、抗疲劳和延缓衰老等作用[2]。
雪莲作为重要的种质资源植物,具有重要的药用价值。野生雪莲由于掠夺性采挖和生态系统的破坏,必然会造成这种珍稀植物资源的匮乏。因此,通过人工培植雪莲的方法来弥补野生雪莲的缺乏非常必要。目前已经有人工培植雪莲的成功报道,但是其相对于野生雪莲的药用价值如何,尤其是在抗炎方面的研究还未见报道。本论文以人工培植的雪莲为原料测定其黄酮含量,并研究其抗炎症作用效果。为人工培植的天山雪莲的药理作用做出初步的评价。
1 实验材料
1.1 试剂与药品 人工培植的雪莲 (广东省佛山雪莲生物科技公司),芦丁(批号:20070912,购自中国药品生物制品检定所),角交叉菜胶(SIGMA公司产品,使用时用无菌生理盐水配成1%浓度悬液),其他试剂均为国产分析纯;丁酸氢化可的松软膏(规格10 g:10 mg,由天津药业集团有限公司生产)。
1.2 动物 40只SD大鼠,体质量(210±40)g,由广东省动物实验中心提供。
2 实验方法
2.1 人工培植雪莲总黄酮的测定(比色法)
2.1.1 人工培植雪莲总黄酮的提取 精密称定取人工培育的雪莲450 g,置1000 ml棕色磨口瓶内,加入65%乙醇750 ml,每日震荡,浸泡30 d后,抽滤,得雪莲醇提液535 ml。
2.1.2 标准品溶液的制备 精密称取在120℃减压干燥至恒重芦丁对照品20 mg置100 ml的量瓶中,加65%乙醇70 ml,置水浴上微热使溶解,室温,加65%乙醇定容得0.2 mg/ml,摇匀,备用。
2.1.3 标准曲线的制备及人工培植雪莲总黄酮测定 精密吸取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml,分别置25 ml容量瓶中,各加水至6 ml,加5% NaNO�2溶液1ml,摇匀,放置6min,加10% Al(NO�3)3溶液1 ml,摇匀,放置6 min,最后加NaOH试液10 ml,再加60%乙醇稀释至刻度,摇匀,放置15 min,在510 nm(使用上海精密科学仪器有限公司的721紫外可见分光光度计)波长处测定吸收度,以吸收度A与浓度C进行直线回归。分别精密吸取醇提液(已抽滤)5 ml(1号、2号、3号),置25ml棕色瓶中,按标准曲线项下的制备方法,自“加水至6 ml”起按要求测定吸光度,以回归方程计算供试液中总黄酮含量,并进一步换算成人工培植雪莲的总黄酮含量。
2.2 人工培植的雪莲黄酮对角叉菜胶所至大鼠足肿胀的影响 取大鼠40只,雌雄各半,按体重随机分为5组:模型组;氢化可的松软膏阳性对照组(氢化可的松软膏用含1% 吐温-80的溶媒稀释成含原料药0.5 mg的剂量);人工培植的雪莲黄酮高浓度组;人工培植的雪莲黄酮中浓度组;人工培植的雪莲黄酮低浓度组。注射药物前分别测量每只大老鼠右后肢足跖厚度为造模前的正常值,纪录数据;然后在每只大鼠右后肢足跖处皮下注射1 %角叉菜胶悬液(0.1 ml/只) 以造成急性足肿胀的炎症动物模型。注药后1、2 h 即造模成功后按顺序于致炎足跖处均匀涂上试药(0.1 ml/足),并包上纱布,胶带固定,防止药物脱落。分别测定注射角叉菜胶后1、2、4、6、8 h 大鼠右后足跖的厚度,以肿胀度和肿胀度作为检测指标。肿胀率和肿胀率的公式如下:
肿胀度(mm)=致炎后足跖厚度-致炎前足跖厚度
肿胀率=致炎后足跖厚度-致炎前足跖厚度致炎前足跖厚度
2.3 人工培植的雪莲黄酮对大鼠棉球致肉芽肿的影响以分析天平精确称取脱脂棉100份,每份5 mg,团成形状和表面积都基本相同的球形。以1.5 kPa压力高压灭菌20 min,每个棉球加氨苄青霉素1 mg/0.1 ml,50℃烘干备用。取大鼠40只,体质量为(200±30)g,雌雄兼用,给每只大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉,在无菌条件下进行手术,分别于两侧腹股沟下各植入灭菌棉球一个,刀口缝合后青、链霉素防止感染。术后将大鼠随机分为人工培植雪莲黄酮:500、100、50 mg/kg,阿司匹林200 mg/kg组和空白对照组,每组8只。手术当天开始灌胃给药,各组大鼠给药7 d(0.2 ml/d),空白对照为每天灌胃生理盐水对照,第8天处死大鼠,打开腹腔,取出棉球,剔尽脂肪组织,60℃干燥至恒重,减去棉球的重量即为肉芽肿的重量。
2.4 统计学方法 实验数据以表示,数据处理采用组间t检验比较各组间差异的显著性。
3 结果
3.1 标准曲线及人工培植雪莲总黄酮的测定结果 标准品在510 nm波长处测定吸收度分别为0.123 5、0.294 3、0.396 2、0.512 3、0.643、0.773,以吸收度A与浓度C进行直线回归,得线性回归方程A=0.629C-0.0162,r=0.997。测试供试液的吸光度,以回归方程计算供试液中总黄酮含量,并进一步换算成人工培植雪莲的总黄酮含量(见表1)。
表1
总黄酮含量测定结果
序号AC(μg/ml)含量(%) 平均含量(%)
1号0.5140.8423.54
2号0.5210.8543.59 3.59
3号0.5300.8683.65
3.2 人工培植的雪莲黄酮对角叉菜胶所至大鼠肿胀的影响 人工培植雪莲醇提物对角叉菜胶引起的大鼠足肿胀的影响结果如表2。
表2
人工培植雪莲醇提物对角叉菜胶引起的大鼠足肿胀的影响(n=8)
组别 剂量�mg/kg
造模后1 h造模后2 h(给药后1 h) 造模后4 h(给药后1 h) 造模后6 h(给药后1 h)造模后8 h(给药后1 h)
肿胀度肿胀率肿胀度肿胀率肿胀度 肿胀率肿胀度肿胀率 肿胀度肿胀率
模型组 - 1.88±0.3435.3±5.631.95±0.45 36.8±3.461.74±0.3632.5±3.481.23±0.3323.3±4.631.23±0.03 23.1±5.36
阳性对照驵 0.51.73±0.3832.6±6.34 1.24±0.5822.5±3.89�* 1.18±0.2821.4±5.34�*0.98±0.15 17.7±5.21�*0.64±0.2211.6±4.12�*
高浓度组2.721.48±0.223.3±7.35 1.23±0.3321.9±4.36�*0.95±0.417.0±5.41�*0.35±0.15 6.25±4.25��** 0.10±0.121.82±5.36��**
中浓度组1.361.55±0.2529.2±6.54 1.73±0.1832.5±4.13�* 0.88±0.28 16.5±7.13�*0.77±0.1 1 14.5±4.63�* 0.52±0.169.89±4.32��**
低浓度组成0.681.75±0.3435.4±3.74 1.9±0.025 38±4.35�*1.33±0.38 26.6±7.36�*1.03±0.1820.5±4.56 0.73±0.1014.5±4.69�*
注:与模型组比较�*P0.05),实验过程中可观察到打开腹腔,取出棉球时给药组和阿司匹林组棉球明显小而干净,肉眼即可观察到给红组和模型组间的差别。
4 讨论
雪莲的药理试验表明,新疆雪莲具有消炎、镇痛及终止妊娠的作用,具有活血通经、散寒除湿、强筋助阳等功效,用于治疗风湿性关节炎、肺寒咳嗽、闭经、胎衣不下、阳痿等疾患;而总黄酮是消炎镇痛的有效成分[1]。文献报道[3],黄酮是雪莲中的重要成分,具有祛痰和类似维生素P的作用,能降低毛细血管通透性,且具有抗病毒、抑制醛糖还原酶的作用。黄酮类化合物与多种药理活性相联系,在护肤保健、防治心血管疾病、治疗风湿疼痛症、延缓衰老、抗癌和计划生育等方面开发利用潜力大[3-5]。因此,对雪莲中黄酮类化合物进行研究有着重要的意义。雪莲总黄酮含量的高低直接影响到药材质量和临床疗效,实验组利用醇提取方法,从人工培植的雪莲中获得醇提取物,测定其总黄酮含量。总黄酮的平均含量达到3.59%。人工培植的雪莲的总黄酮含量完全能满足临床的应用标准。
本实验采用急性炎症模型(角叉菜胶所至大鼠足肿胀)和慢性炎症模型(棉球诱导的大鼠肉芽肿)[6],该炎症模型具有很高的可重复性。该模型模拟临床中急慢性炎症,被广泛应用于炎症的机制和治疗的研究。人工培植的雪莲总黄酮的抗炎症实验结果表明,其能减少大鼠足肿胀和棉球诱导的大鼠肉芽肿,说明人工培植的雪莲总黄酮具有明显的抗炎症作用,本研究为人工培植雪莲总黄酮的药理研究和深入的药学研究奠定了基础,人工培植雪莲总黄酮的抗炎症作用的活性成分及其作用机制有待进一步的研究。
参 考 文 献
[1] 朱晨.野生与种植雪莲花的总黄酮含量比较.中国中医药学杂志,2002,37(2):37.
[2] 李燕,郭顺星,王春兰,等.新疆雪莲黄酮类化学成分的研究.中国药学杂志,2007,42(8):575.
[3] Zhao Li,Wang Xiaoling.Research on chemical composition f pharmacology and its clinic application of Saussurea Involucrata.Journal of Southwest University for Nationalities (Natural Sciencise Edition),2003,29(4):424.
[4] 刘勇明.维吾尔药志(上) .新疆科技卫生出版社,1999 :490.
[5] 顾云,谢金萍,杨云.雪莲注射液穴位注射治疗类风湿性关节炎60例.山西中医,2009,25(3):30.
[6] 刘建东.赤雹果乙醇提取物的抗炎作用的实验研究.中国医药指南,2009,7(2):40.
