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[摘要] 目的 髓过氧化物酶（MPO）是动物中性粒细胞中的一种血红素蛋白，有多种生物活性。本研究拟通过分析原始脊椎动物斑马鱼MPO基因的序列和结构，为研究动物MPO演化提供证据。方法 利用RACE技术和生物信息学技术从斑马鱼cDNA中鉴定了一个MPO基因并对其序列和结构进行分析。结果 通过序列比对和结构分析发现，斑马鱼MPO与哺乳动物、鸟类和其他鱼类的髓过氧化物酶基因具有高度序列和结构的相似性。结论 斑马鱼的MPO在动物MPO演化过程中处于过渡地位。
[关键词] 髓过氧化物酶；RACE；斑马鱼
[中图分类号] Q78 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）24-08-03
Cloning and Characterization of Myeloperoxidase Gene from Zebrafish （Danio rerio）
DONG Chaohua
College of Life Sciences， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China
[Abstract] Objective Myeloperoxidase （MPO） is a hemoprotein present in the animal neutrophils and it has a variety of biological activities. The objective of the present study is to provide evidences for investigating the evolution of MPO. Methods A new MPO gene was cloned and characterized using RACE technology from zebrafish. Sequence and structural analysis was performed using bioinformatics technology. Results Sequence alignment and structural analysis showed that zebrafish MPO had high sequence and structural similarities with other myeloperoxidase from mammals， birds and other fishes. Conclusion MPO identified from zebrafish is in a transitional position.
[Key words] Myeloperoxidase； RACE； Zebrafish
髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）是动物中性粒细胞中的一种血红素蛋白，有多种生物活性，与许多疾病的发生与发展密切相关[1-4]。MPO不仅在高等哺乳动物中存在，在低等无脊椎动物如虾、蟹、果蝇中都发现了MPO的同系物。从无脊椎动物到脊椎动物，MPO功能发生了很大的变化[1-6]，MPO功能演化是一个有趣的课题。斑马鱼作为一种典型的模式生物研究分子演化具有突出的优势。本研究以斑马鱼为材料鉴定其MPO基因，并对其结构与功能进行分析，以期为MPO功能的演化提供证据。
1 资料与方法
1.1 实验动物
实验用斑马鱼从本地观赏鱼商店购买。
1.2 RNA提取及cDNA第一链合成
总RNA提取和cDNA第一链合成利用TaKaRa公司的RNA isolation及反转录试剂盒，根据试剂制造商提供的说明进行。基因末端的克隆用Clonetech公司的SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit进行。
1.3 生物信息学分析
基因序列和蛋白质序列相似性分析用BLAST软件进行，多重序列比对用Clustal W程序和多重序列显示程序。信号肽预测用SignalP 3.0程序，进化树构建用MEGA 4.0程序和邻位相连法（neighbor-joining）。蛋白质结构特征分析用蛋白质分析专家系统和运用简单模块构架搜索工具进行。
2 结果
2.1 基因克隆和序列分析
用tBLAST程序搜索斑马鱼WSG库，获得目标基因的候选序列并以此序列为基础，通过RACE技术获得基因全长，命名为DrMPO（图1）。
DrMPO全长3329bp，包括415bp的3’末端非编码序列和404bp的5’端非编码区。编码区序列为2511bp，编码836个氨基酸。利用ExPASy系统推定DrMPO蛋白质分子量为92.7kDa，理论等电点为8.40。用SMART程序对推定的氨基酸序列进行结构预测和位点扫描。DrMPO在N末端有一个19个氨基酸的信号肽，同时还包含有两个过氧化物酶结构域和一个C1q结构域。
2.2 序列比对
通过BLAST程序搜索蛋白数据对DrMPO进行同源性分析。DrMPO与鳜鱼Siniperca chuatsi、原鸡Gallus gallus、鲶鱼Ictalurus punctatus、非洲爪蟾Xenopus laevis、大西洋鲑Salmo salar、人Homo sapiens和小鼠Mus musculus的MPO分别有69%、57%、82%、58%、80%、64%和57%的相似性。
通过将DrMPO与其他物种的MPO进行多重比对，发现DrMPO与其他动物MPO在过氧化物酶结构域高度保守（图2），其他动物大都没有C1q结构域。
2.3 多聚系统树的构建
将不同物种MPO按邻接法构建系统树。系统树显示，DrMPO与鲶鱼的MPO组成一个群体而鳜鱼和大西洋鲑鱼则组成另外一个小群，这两个小群组成一个大群，区别于小鼠和人组成的哺乳动物群以及原鸡和非洲爪蟾组成的群。聚类结果显示，DrMPO与鲶鱼的MPO亲缘关系最近，而原鸡与两栖类的非洲爪蟾的MPO亲缘关系最近。聚类结果显示了MPO的歧化趋势与动物的演化地位相一致，处于演化的过渡地位（图3）。
2.4 空间结构模型的建立
利用SWISS-MODEL软件对DrMPO的空间结构进行预测，并与经典的人MPO空间模型进行比较。DrMPO与经典的MPO具有相似的空间结构（图4），有12个β折叠、12个α螺旋，共24个二级结构元件。有两对4个二硫键和6个长环状结构。
3 讨论
髓过氧化物酶是动物体内的一个重要免疫分子，在维持体内的免疫平衡、清除氧自由基以及信号转导等方面都有非常重要的作用，是动物固有免疫和适应性免疫不可或缺的组分[1，2]。高等的哺乳动物与低等的节肢动物中都有MPO蛋白的存在[5-8]，但在这两类动物中MPO的结构和功能有很大的区别。MPO功能的演化对于理解动物免疫系统的演化是一个很好的参考模型。而对于处于动物演化过渡地位的原始有颌类脊椎动物鱼类MPO的研究就具有重要的意义。本研究从斑马鱼这一鱼类的重要模式生物中分离鉴定了MPO基因，并对其结构和功能进行了分析。结果表明斑马鱼与其他脊椎动物的MPO和无脊椎动物MPO的同系物相似，都有一个过氧化物酶结构域。这一过氧化物酶结构域是中性粒细胞中在氧存在的情况下，通过氧化反应杀灭病原微生物的主要功能域[5]。除此之外，在无脊椎动物中该功能域还具有黏附活性，参与包掩、黏附、吞噬等免疫功能，同时还与前酚氧化酶系统相关联[6]。在脊椎动物中，这一结构域还与多种疾病的发生发展相关联。除了过氧化物酶结构域外，在斑马鱼的MPO中还包含C1q结构域，这一结构域在高等哺乳动物和无脊椎动物MPO中都不具有，是动物补体系统的一个受体蛋白的C1q功能域[9]。C1q是补体C1的一个亚基，补体C1q可以与免疫球蛋白的Fc段结合，启动补体的经典激活途径，也可以与免疫细胞表面的C1q受体及针对C1q的自身抗体（C1qAb）结合[9]。C1q结构域在鱼类的MPO中出现说明早期的MPO的功能是与补体系统相关联的。在低等的无脊椎动物中MPO的同系物peroxinectin是前酚氧化酶系统的组成部分，而前酚氧化酶系统的功能与脊椎动物补体系统的功能相类似[5]，这说明MPO的功能最早可能与补体相关联，到鱼类以后的脊椎动物逐渐演化与补体系统相分离，独立行使功能。DrMPO具有经典MPO的典型结构域过氧化物酶结构域和补体系统的C1q结构域这一事实表明，斑马鱼MPO处于MPO结构和功能从低等无脊椎动物到高等脊椎动物的演化的过渡地位。
多重序列比对和系统树构建结果表明，斑马鱼MPO尽管与其他鱼类MPO聚在一起成为一个群，但鱼类MPO也有很明显的歧化，如图3所示斑马鱼、鲶鱼和大西洋鲑、鳜鱼的MPO歧化显著。这说明作为一种过渡类型MPO，其结构多样性也决定了其可以有不同的功能演化，鸟类和两栖类的MPO明显不同于哺乳类动物的MPO[10]。MPO的空间结构模型表明其与哺乳类MPO的空间模型及甲壳动物peroxinectin的空间模型有显著的不同，如图4所示这一不同主要体现在C1q结构域。而对于过氧化物酶的二级结构组成，则与脊椎动物的MPO更为类似。
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（收稿日期：2011-07-08）
