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[摘要]目的 了解三氧化二砷对胃腺癌SGC7901细胞株细胞增殖、细胞凋亡以及bcl-2、cyclin D1基因表达的影响。方法 分别以不同浓度的三氧化二砷作用于SGC7901细胞,作用不同时间后采用MTT检测法对细胞增殖活性进行检测;采用流式细胞仪(FCM)AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率;逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测bcl-2、cyclinD1基因转录水平。结果 稍高浓度(≥2μmol/L)的三氧化二砷可抑制SGC7901细胞增殖,并有剂量和时间依赖性。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测bcl-2、cyclin D1基因转录水平,发现三氧化二砷作用组bcl-2、cyclin D1基因的表达与对照组比较明显减低(P 1.2.2Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率采用流式细胞仪(FCM)Annexin V/PI双染法检测:取对数生长期细胞,以(1×106)个/孔的密度种植于25cm培养瓶,培养48h细胞贴壁后,加三氧化二砷至不同终浓度,孵育48h后收集所有悬浮及贴壁细胞。1000rpm离心3min弃上清,Annexin V-F ITC 结合液重悬细胞,室温避光孵育10min,离心,弃上清,Annexin V-F ITC结合液重悬细胞,PI冰盒中避光孵育10min,随即上机检测。每组检测10000个细胞。
1.2.3逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测bcl-2、cyclin D1基因转录水平取对数生长期细胞,调整细胞浓度为(1×106)个/mL,接种于25cm培养瓶。分组方法为药物干预组和对照组两大组,其中干预组分别加入浓度为1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L的三氧化二砷。培养48h后,分别收集各组细胞,行RT-PCR检测相关基因的表达。
①总RNA提取:以trizol法提取总RNA,1.2%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计测定A260/A280。确定RNA浓度和纯度,纯度为1.8~2.0。②cDNA 合成:20mL逆转录体系中,含有总RNA1μg,10μM oligo(dT)15 2μL,2.5mMeach dNTP2μL,5×First-Strand Buffer 4μL,0.1M DTT1μL,40U/μLRnase 0.5μL,200 U /μLTIANScript M-MLV 1μL,加ddH2O,至体积20μL。经70℃5min、42℃50min、95℃5min终止反应合成cDNA。③PCR扩增检测bcl-2、cyclin D1基因的表达:PremierPrimer 5设计引物,bcl-2上游引物5’- TTGGATCAGGGAGTTGGAAG- 3’,下游引物5’- TGTCCCTACCAACCAGAAGG-3’,扩增产物295bp;cyclinD1 上游引物5’-CTGGCCAT2GAACTACCTGGA - 3’,下游引物5’-GTCACACTTGATCACTCTGG-3’,扩增产物483bp;β肌动蛋白(β-actin)作内参照,上游引物5’- AAACTGGAACGGTGAAGGTG-3’,下游引物5’-GTGGCTTTT AGGATGGCAAG-3’,扩增产物160bp。PCR反应体系为:25μL,cDNA2μL,10pmol/μL的上下游引物各0. 5μL,10×Taq Buffer2.5μL,2.5mM dNTP Mixture 4μL,2.5U/μL Taq 0.5μL,补ddH2O至体积25μL。94℃预变性3min,94℃30s、58℃30s、72℃60s30个循环。72℃延伸5min。
PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳,以DNA Marker标记确定条带大小。凝胶扫描成像分析系统进行摄像后并对凝胶条带灰度信号强度半定量分析。以bcl-2/β-actin及cyclin D1 /β-actin的比值作为bcl-2、cyclin D1的相对表达强度。
1.3统计学处理
实验数据以(χ±s)表示,采用SPSS13.0软件分析处理数据,连续型变量比较采用t检验,多样本均数比较采用单因素方差分析,分类变量比较采用卡方检验。P0.05),而较高浓度组与对照组比较细胞凋亡数差异有显著性(P0.05),而在较高浓度其比值有明显差异(P [参考文献]
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(收稿日期:2009-10-26)
