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[摘要] 目的 探讨血清甲壳质酶蛋白40（YKL-40）在冠状动脉粥样硬化发生发展中的价值以及YKL-40水平和hs-CRP与疾病的相关性。方法 用酶联免疫吸附法（ELISA）测定18例冠脉造影至少一支冠脉血管及其主要分支狭窄≥50％和25例健康状况良好、未发现心脏相关疾病者血清中的YKL-40水平。比较血清YKL-40在两组间的差异，用Pearson相关性分析检查实验组YKL-40水平与hs-CRP的相关性。结果 狭窄≥50％组患者血清YKL-40水平（161.75±27.23）μg/L[（80.01～547.12）μg/L]，显著高于健康组（95.98±20.12）μg/L[（54.32～199.13）μg/L]，差异具有统计学意义（P=0.001），实验组YKL-40水平与hs-CRP之间有相关性，而健康组之间没有相关性。结论 血清YKL-40水平检测在冠状动脉粥样硬化的诊断方面有较高的临床价值。
[关键词] 血清甲壳质酶蛋白40；冠状动脉粥样硬化；超敏C反应蛋白
[中图分类号] R543.5[文献标识码] B[文章编号] 1673-9701（2011）19-44-03
动脉粥样硬化在我国是严重危害公众健康的常见病和多发病，近年发病率呈逐年增长趋势，是一种血管内皮损伤后的慢性炎症增生性疾病，多发生在大中动脉，其发生是一个复杂的、受多种致病因素影响的病理生理过程。大量研究证实[1，2]，炎症反应通过炎症介质来调控内皮细胞、平滑肌细胞和炎性细胞的增殖，从而推动粥样斑块病变的程度和斑块结构的改变，因此它贯穿了从脂质堆积到斑块进展及血栓形成的整个过程，可见炎症在动脉粥样硬化的发生、发展及导致并发症中起着非常重要作用。
1985年Vlaicu等[3]第一次证实了人主动脉粥样硬化斑块中存在超敏C反应蛋白，Torzewski等[4]发现在人类冠状动脉粥样硬化斑块早期病变中有大量CRP沉积存在，在新生内膜近中膜处最为明显，并且泡沫细胞中也存在着CRP阳性染色。在心肌梗死患者、糖尿病患者和高血压患者体内都存在着CRP基础水平的升高，并且CRP的升高程度与发生急性心血管事件的危险度具有相关性，当CRP每升高一个标准差时，非致死性心肌梗死和心源性猝死的危险性就会升高45％，所以炎性因子CRP已经被广泛认为是冠心病危险程度的标志之一[5]。
YKL-40 属于哺乳动物甲壳酶样蛋白家族成员之一，但不具有甲壳酶活性，最早是在一项寻找新的骨蛋白的研究中发现的。人体内多种细胞，包括免疫细胞、动脉血管内皮细胞和动脉血管平滑肌细胞等都能分泌YKL-40，研究[6]表明YKL-40能够由粥样硬化斑块中充满脂质的巨噬细胞大量分泌，特别是渗透到病灶深层的巨噬细胞，由此可以推测血浆YKL-40参与了非心血管性炎症疾病的基质重构和新生血管的形成，其水平的高低可能和动脉粥样硬化血管壁中充满脂质的巨噬细胞活性有关，YKL-40可能参与了动脉粥样硬化的形成，然而其中的具体关系尚不清楚。本研究根据病变狭窄的范围和程度，初步探讨冠心病患者血浆YKL-40水平与病情严重程度及冠脉病变狭窄的范围和程度的关系，分析YKL-40作为一种新的炎症因子探求其水平检测对评估冠心病患者病情和预后的临床意义。
1资料与方法
1.1一般资料
选取的血液标本来源于焦作市矿务局中央医院2009年3月～2010年6月期间住院病例。狭窄≥50％组患者18例，年龄37～79岁，平均62.3岁；男11例，女7例；有完整的临床资料。健康患者选自焦作市矿务局中央医院门诊体检者25例，年龄35～78岁，平均60.2岁；男14例，女11例。健康者和动脉粥样硬化患者均否认具有近期服药史、肝病史、哮喘病史及关节炎病史。
1.2方法
所有患者均行冠脉造影（coronary angiography，CAG），由两名有经验的心脏血管造影医生根据CAG结果采用Gensini评分评估冠脉病变狭窄程度（见图1）。分组抽取患者静脉血3～5mL，保存于非抗凝管内。常温下血液凝固至少30min，不超过3h（不加抗凝剂），3000r/min，离心10min，分离血清，-20℃储藏直至使用。所有血清标本均避免溶血和反复冻融。采用YKL-40 ELA试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司）测定血清中YKL-40浓度。根据说明书向酶标包被微孔中准确加入50μL稀释5倍的标准品或样品，37℃温育30min，加入酶标试剂50μL，37℃温育30min，若标本中有抗原即与抗体结合，未结合的酶标试剂则被洗去；加入显色剂，37℃避光显色10min，加入终止液后，在450nm测其吸光度，根据标准品浓度与吸光度之间关系绘制标准曲线，算出回归方程，然后根据所测血清标本的吸光度求出其中的YKL-40浓度。所有患者均于入院后次日清晨抽取空腹8h以上静脉血送检验科，采用全自动生化分析仪检测hs-CRP。
1.3统计学处理
数据统计处理中计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。相关性检验采用Pearson相关分析。
2结果
2.1两组血清YKL-40的比较
狭窄≥50％组患者血清YKL-40水平（161.75±27.23）μg/L[（80.01～547.12）μg/L]，显著高于健康组（95.98±20.12）μg/L[（54.32～199.13）μg/L]，差异具有统计学意义（P=0.001）。见表1。
2.2YKL-40与hs-CRP水平相关性分析
Pearson相关性分析显示，动脉粥样硬化组YKL-40与hs-CRP水平的相关系数r=0.639，P=0.004，见图2；而对照组之间没有相关性，相关系数r=0.106，P=0.613，见图3。
3讨论
动脉粥样硬化是一种血管内皮损伤后的慢性炎症增生性疾病，多发生在大中动脉。其发生是一个复杂的、受多种致病因素影响的病理生理过程，多种高危因素如感染、低密度脂蛋白、高血压等导致血管内皮缺血、缺氧和氧化应激，进而造成内皮功能降低。内皮细胞上黏附分子的表达是动脉粥样硬化病变早期。黏附分子如单核细胞化学趋化蛋白，诱导炎症细胞吸附在内皮组织上，随后迁移至内膜下间隙并且启动了其局部的炎症反应。巨噬细胞在其集落刺激因子的作用下，大量表达清道夫受体，同时不断吞噬进入内膜发生氧化的低密度脂蛋白，从而形成单核细胞源性泡沫细胞[7]，开始脂质堆积，T淋巴细胞释放γ-干扰素和淋巴细胞毒素，各种细胞因子刺激基质金属蛋白酶（MMPs）分泌，如MMP-2、MMP-9等，同时刺激血管内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞的增殖[8]。随着炎症的进展，活化的粒细胞还能释放肽类生长因子，促进平滑肌细胞的增殖，这样就使得粥样斑块进入纤维化期。所有这些细胞生成的介质促进了纤维化、血管平滑肌细胞的增殖和细胞外基质的生成。另外，活化的巨噬细胞还能释放出多种蛋白水解酶，从而使得细胞外基质被降解及斑块表面纤维帽变薄，斑块结构改变，随着脂质核心的逐渐增长和纤维帽的不断销蚀，最终导致斑块破裂。另外巨噬细胞还可以释放组织因子，成为斑块破裂后血栓形成的始动因素[9]。
近年来发现了一种新的血清炎症标志物YKL-40，它在生理状态和病理状态下都有表达，在细胞外基质的降解、炎症发展和重构中也发挥着非常重要的作用[10]， 但是确切的生物功能至今还不是十分清楚；另外在有炎症一同存在的情况下，YKL-40也是滑液细胞、软骨细胞和纤维母细胞的增殖因子，它主要在正常的中幼粒细胞、晚幼粒细胞中合成，合成的YKL-40储存在成熟中性粒细胞的细胞颗粒中，然后中性粒细胞损坏和活化时能通过胞吐方式将其释放出来。YKL-40是在巨噬细胞活化晚期分泌的，被认为是一种炎症蛋白[11]。本次研究主要是通过检测冠状动脉粥样硬化患者和健康者血清YKL-40水平，探讨YKL-40与冠脉病变狭窄的范围和程度的关系。
人类软骨糖蛋白-39（YKL-40），又称MMP-2，属于MMPs家族，该家族为锌依赖性内肽酶，能降解细胞基质，目前发现的已有20多种。YKL-40（MMP-2）与MMP-9同为明胶酶，主要降解Ⅳ型胶原和层粘连蛋白，YKL-40基因位于染色体（1q32.1），Durpuis等[12]可以影响炎症指标的水平并且在心血管疾病的发生发展中发挥作用的染色体位于一号染色体上。大量研究表明动脉粥样硬化相关疾病的发生发展与慢性亚临床炎症有着重要的相关关系：动脉粥样硬化以血管平滑肌细胞、内皮的异常功能改变和细胞外基质重构为特征。YKL-40――一个新的炎症因子，已有研究表明它在炎症环境中能够促进血管平滑肌细胞从内膜到中膜的迁移增殖、促进细胞黏附和增殖、启动细胞抗凋亡机制以及促进细胞外基质重构等。一个有关动脉粥样硬化生化指标的体外研究[13]，采用蛋白组学方法发现，在使用氧化型低密度脂蛋白处理后，在巨噬细胞的上清液中YKL-40水平有较高的表达，从而形成 “泡沫细胞”，提示YKL-40在动脉粥样硬化的斑块生成过程中发挥着促进单核细胞分化成充满脂质的巨噬细胞的作用，因此可以说YKL-40是炎症组织局部巨噬细胞激活的特异性血清学指标。Boot等[14]采用原位杂交技术研究了人股动脉壁动脉粥样硬化斑块的YKL-40基因表达，这个研究发现大量不同亚群的巨噬细胞均表达较多的YKL-40，特别是渗透到病灶深层的巨噬细胞，而且动脉粥样硬化早期病变中的巨噬细胞分泌了最多的YKL-40。由此推测YKL-40可能与动脉粥样硬化斑块的发生与发展有密切的关系，并且与粥样斑块形成、内皮功能不全和斑块的不稳定性有相关性。另外YKL-40也可以使得血管内皮细胞发生形态学上的变化，例如促进血管形成分支小管，研究提示YKL-40可以通过促进血管平滑肌细胞的迁移增殖和重构从而促进血管生成[15]。Register等[16]探讨YKL-40水平与饮食诱导的短尾猴动脉粥样硬化的关系发现，冠脉粥样硬化的范围大小与血清YKL-40水平高低明显相关。然而，YKL-40在动脉粥样硬化中的确切作用机制尚未完全阐明。
本研究发现，动脉粥样硬化患者血清中YKL-40水平显著高于正常对照组，提示YKL-40可作为动脉粥样硬化诊断的参考。Pearson相关性分析显示动脉粥样硬化组YKL-40与hs-CRP水平成正相关，而对照组之间没有相关性，冠心病患者血浆YKL-40水平与常用炎症指标hs-CRP水平独立正相关。YKL-40作为诊断动脉粥样硬化新的血清学标志物具有一定的临床价值。
YKL-40除能表示炎症程度外，还能够评估冠脉疾病的严重程度和斑块不稳定性，当然这需要更多多中心、大样本的研究。YKL-40有望成为冠心病等动脉粥样硬化疾病的新的监测指标，今后的研究方向可以探讨YKL-40在心肌损伤、新生血管形成、动脉粥样硬化斑块中的具体作用机制及其作为冠脉疾病的发生风险与预后和预测因子的可行性，探讨其在急性心肌梗死、冠脉综合征等冠脉疾病临床应用中的价值。
[参考文献]
[1] Ross R. Atherosclerosis-an inflammatory disease[J]. N Engl J Med，1999，340（2）：115-126.
[2] Libby P，Ridker PM，Maseri A. Inflammation and atheroselerosis[J]. Circulation，2002，105（9）：1135-1143.
[3] Vlaicu R，Rus HG，Niculescu F，et al. Immunoglobulins and complement components in human aortic atherosclerotic intima[J]. Atherosclerosis，1985，55（1）：35-50.
[4] Torzewski J，Torzewski M，Bowyer DE，et a1. C-reactive protein frequently colocalizes with the terminal complement complex in the intima of early atherosclerotic lesions of human coronary arteries[J]. Arterioscler Thromb Vasc BioL，1998，18（9）：1386-1392.
[5] Briggs JE，McKeown PP. Angiographically confirmed coronary heart disease and periodontal disease in middle-aged males[J]. Periodontol，2006，77（1）：95-102.
[6] Boot RG，Van Achterberg TA，van Aken BE，et a1. Strong induction of members of the chitinase family of proteins in atherosclerosis：chitotriosidase and human cartilage gp-39 expressed in lesion macrophages[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，1999，19：687-694.
[7] Qiao JH，Tripathi J，mishra NK，et al. Role of macrophage colony-stimulating factor in atherosclerosis：studies of osteopetrotic mice[J]. Am J Pathol，1997，150（5）：1687-1699.
[8] Hansson G，Libby P. Tissue and cell distribution of copper，zinc and cadmium in the mussel，mytilus galloprovincialis，determined by autometallography[J]. New York：Lippincoot-Raven，1996，28（5）：557-568.
[9] Libby P，Simon DI. Inflammation and thrombosis：the clot thickens[J]. Circulation， 2001，103（13）：1718-1720.
[10] Cintin C，Johansen JS，Skov F，et a1. Accumulation of the neutrophil-derived protein YKL-40 during storage of various blood components[J]. Inflamm Res，2001，50（2）：107-111.
[11] Krause SW，Rehli M，Kreutz M，et a1. Differential screening identifies genetic markers of monocyte to macrophage maturation[J]. J Leukoc Biol，1996，60（4）：540-546.
[12] Durpuis J，Larson MG，Ramachandran SV，et a1. Genome scan of systemic biomarkers ofvascular inflammation in the Framingham Heart Study：evidence for susceptibility loci on lq[J]. Atherosclerosis，2005，182（2）：307-314.
[13] Fach EM，Garulacan LA，Gao J，et a1. In vitro biomarker discovery for atherosclerosis by proteomics[J]. Mol Cell Proteomics.2004，3（12）：1200-1210.
[14] Boot RG，Van Achterberg TA，van Aken BE，et a1. Strong induction of members of the chitinase family of proteins in atherosclerosis：chitotriosidase and human cartilage gp-39 expressed in lesion macrophages[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，1999，19（3）：687-694.
[15] Alinda KM，Ponce L，Kleinman HK，et a1. Gp38k，a protein synthesized by vascular smooth muscle cells，stimulates directional migration of human umbilical vein endothelial cells[J]. Exp Cell Res，1999，250（1）：168-173.
[16] Register TC，Carlson CS，Adams MR. Serum YKL-40 is associated with osteoarthritis and atherosclerosis in nonhuman primates[J]. Clin Chem，2001，47（12）：2159-2161.
（收稿日期：2011-03-10）
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