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陈伟鸿，韦浩纯，吴琪琪，段小群，周越菡
桂林医学院药学院 广西桂林 541100
炎症是一种常见而又十分重要的基本病理过程，与神经系统退行性疾病、恶性肿瘤等多种致命性疾病有密切相关[1]，临床上常用的抗炎药如糖皮质激素、非甾体抗炎药，但上述药物在治疗过程中常伴随机体代谢功能紊乱、胃肠反应等副作用[2]，因此，发掘高效低毒的抗炎活性药物，是炎症治疗的重要领域。中医理论认为炎症的核心病机为邪气内聚，癥瘕集聚，中医药有着数千年的历史且对于治疗炎症屡建奇功[3]，2016年国务院颁布了《中医药发展战略规划纲要（2016-2030年）》，明确中药研究是中药开发与应用的关键科学问题。因此，从我国传统中草药中发掘具有抗炎作用的中草药，将具有重要的科学意义及应用价值[4]。网络药理学是由Andrew L Hopkins首先提出的，应用网络分析方法研究药物作用靶点的一系列方法，为现代中医药的研究提供了新的思路[5]。
叶下珠（Phyllanthus urinariaL.），又名珍珠草，主要分布于我国的广西、广东等地，是大戟科叶下珠属的全草，最早收载于《生草药性备要》中，具有平肝清热、利水解毒等功效[6]。近年国内外学者对于叶下珠的药理相关研究主要集中于保肝、抗肿瘤、抗病原微生物、抗氧化、抗血栓等方面[7]，对其抗炎效应鲜有研究。
本文通过网络药理学的研究方法，初步探索叶下珠抗炎的相关机制，并通过体外实验研究AEP对LPS刺激的RAW264.7细胞NO分泌的调节作用和具体作用机制，为叶下珠的开发和利用提供理论基础。
1 材料
1.1 药品与试剂 叶下珠水提物由桂林医学院药物化学教研室提供，马瑞婧博士鉴定。高糖培养基DMEM购自于Gibco，上海立菲生物技术有限公司；
胎牛血清（Fetal Bovine Calf Serum，FBS）购自于LONSERA，上海双洳生物科技有限公司；
双抗（链霉素+青霉素）购自于Hyclone；
二甲基亚砜（DMSO）购自于SIGMA；
四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自于BIOFROXX；
脂 多 糖（Lipopolysaccharide，LPS）购 自 于SIGMA；
ELISA （NO）试剂盒购自于Elabscience，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；
BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白酶抑制剂混合液（Proease Inhibitor Cocktail（EDTA-free））、RIPI组织细胞裂解液、BSA蛋白标准、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）购自于Beyotime，碧云天生物科技有限公司；
30%丙烯酰胺溶 液、1.5mol/L Tris（Ph8.8）、1.0mol/L Tris（pH6.8）、10%SDS、过硫酸、TEMED购自于Solarbio，北京索莱宝科技有限公司；
一抗NF-kappaB p65 Rabbit mAb购自于Cell Signaling Technology；
一抗GAPDH Rabbit mAb、二抗HRP标记山羊抗小鼠lgG（H+L）、二抗HRP标记山羊抗兔lgG（H+L）购自于 Beyotime，碧云天生物科技有限公司；
发光液购自于凯基生物。
1.2 仪器 酶标仪购自于美国伯腾仪器有限公司（BioTek），型号：ELx800；
连续波长酶标仪购自于Bio TeK Instruments；
DSY5000X倒置显微镜购自于重庆重光实业有限公司；
二氧化碳孵育箱购自于SANYO，Japan；
低温离心机购自于EPPENDORF，型号：5424R；
Tanon-5200购自于上海天能科技有限公司；
电热恒温培养箱购自于上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 细胞株 小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞购自于中科院上海细胞库，培养于含10%胎牛血清及1%的双抗（青霉素和链霉素）的DMEM高糖培养基中，置于37℃、含5%CO2的饱和湿度的培养箱中培养。
2 方法
2.1 网络药理学研究
2.1.1 获得叶下珠抗炎的作用靶点 在HERB数据库的Herb板块以“叶下珠”为关键词获得叶下珠相关的作用靶点，将上述靶点导入Cytoscape3.8.2软件构建“药物-靶点”网络。利用GeneCards数据库以“inflammation”为关键词获得炎症的相关靶点，通过韦恩软件对叶下珠的作用靶点与炎症的疾病靶点进行取交集并绘制韦恩图。
2.1.2 初步的PPI可视化与关键核心靶点筛选 将上述获得的交集靶点导入STRING数据库获得初步的蛋白互作网络（PPI），在最低互作分数（minimum required interaction score）选择medium confidence（0.400），并选择隐藏未连接的节点，选择保存为TSV文件，导入Cytoscape3.8.2软件进行可视化处理，运用MCODE插件寻找最有意义的模块，通过CytoHubba插件筛选得到10个关键核心靶点。
2.1.3 GO功能富集分析、KEGG通路富集分析 将上述10个关键核心靶点导入Hiplot数据库进行GO、KEGG富集分析，并绘制GO富集分析的气泡图和KEGG的柱状图。将KEGG富集结果的部分信号通路和重要核心靶点基因信息导入Cytoscape 3.8.2软件中，构建“靶点-通路”网络，进行KEGG通路富集分析结果的可视化。见表1。
表1 数据库信息
2.2 体外研究
2.2.1 细胞培养 将小鼠巨噬细胞RAW264.7培养于DMEM完全培养基，即含10%胎牛血清及1%的双抗（青霉素和链霉素）的DMEM高糖培养基中，置于37℃、含5%CO2的饱和湿度的培养箱中培养，取生长状态处于对数期的细胞用于实验。
2.2.2 AEP的制备的制备 叶下珠干燥全草后，使用粉碎机对叶下珠进行粉碎，过筛，称取过筛后的粉末，每150g粉末加入2L蒸馏水后煮沸2h，得到水煎液，待自然冷却后过滤得到滤液。而滤渣则继续加入1.15L蒸馏水后煮沸2h，上述步骤重复2次，合并3次操作得到的滤液，浓缩后，得到浸膏33g，然后用DMSO配制成1g/mL的储存液，无菌处理后分装保存于-20℃，临用前用稀释到实验时用DMSO稀释到相应浓度备用。
2.2.3 MTT法检测AEP对RAW264.7细胞活力的影响 将RAW264.7细胞复苏、培养、传代，待细胞生长至75%以上且处于对数生长期时，将细胞分别培养于96孔细胞板，分为24h、48h、72h三个实验组，每组再设有空白对照组（即药物浓度为0）、溶剂组v和同种药物的不同浓度梯度给药组，给药组再分为5组，具体浓度分为0.0625，0.125，0.25，0.5，1（单位：mg/ml），使用DMSO溶解药物。具体操作如下：将处于对数生长期的RAW264.7细胞通过细胞刮将细胞从培养皿壁刮下，加入完全培养基，吹打均匀，调整细胞密度为10个/μL，每孔为100 μL的量，接种于24 h、48 h、72 h三个分组的96孔板中，24h过后，观察到细胞贴壁，弃置旧培养基。每组设置3个复孔，给药组加入含不同药物浓度的AEP的完全培养基，空白对照组加入完全培养基，溶剂组加入含DMSO的培养基，且溶剂组中所加的DMSO与溶解最高药物浓度的含量一致。进行上述步骤后将96孔板置于37℃、含5%CO2的饱和湿度的培养箱中培养。24 h后取出24h组的96孔板，加入浓度为5mg/ml的MTT溶剂10μL，放置培养箱孵育3-4 h，弃去培养液，每孔加入DMSO 100 μL，置于摇床上摇15min使结晶溶解，使用酶标仪在490 nm波长处测量吸光度值，计算细胞活力变化。其余48 h、72h组给药后分别培养48 h、72h，进行上述相同操作。
2.2.4 AEP作用细胞后对细胞炎性因子检测 根据MTT法结果分析，取药物浓度为0.0625、0.125 mg/ml的药物浓度进行细胞炎性因子检测。通过细胞刮将细胞从培养皿壁刮下，加入完全培养基，吹打均匀，调整细胞密度为1× 105个/mL，每孔1mL，接种于24孔板，标记空白对照组0、LPS组、LPS +AEP组，放置于培养箱中培养；
同时配制不同浓度的AEP（质量浓度 为0.0625mg/ml、0.125mg/ml）和1μg/ml LPS药液备用，待24孔板细胞密度至75%-85%后对药物组进行给纯药于CO2培养箱保护2h，其他孔不换液；
2h后取24孔板进行处理，0组更换完全培养基，LPS组给予LPS处理，药物组给予LPS+纯药处理，上述操作后置于培养箱中培养，待24 h后通过ELISA试剂盒来检测上清NO分泌情况，每组设置3个复孔。
2.2.5 免疫印迹法对细胞经药物处理后检测NF-κB p65蛋白表达 将RAW264.7细胞培养于中皿中，每个皿中细胞个数为5×105个/mL，共4ml。设置空白对照组0、LPS组、LPS +AEP各浓度组，标记好后将细胞放入CO2培养箱进行培养，待细胞贴壁生长至75%～85%后，LPS +AEP各浓度组中细胞给予配置好的AEP药液进行对应给药处理2h，对其他组别不处理；
2h后取24孔板处理，0组换完全培养基，LPS组给LPS处理，药物组给LPS+纯药处理，放于培养箱中培养24h后取出加裂解液（RIPI：蛋白酶抑制剂=100：1），离心，吸取上层清液，进行蛋白定量实验，按比例加上样缓冲液，根据蛋白定量的结果计算所需的上样量。制备12%胶，按蛋白定量后的数据进行上样，进行电泳（浓缩胶：80 v，30 min ；
分离胶：120 v，60 min），转膜（200 mA，80 min），转膜结束后置于牛奶液中封闭（37℃，120min），封闭结束后放置于TBST中洗3次，10 min/次，4℃孵一抗过夜。次日，用TBST漂洗3次，10 min/次，孵二抗120 min后，用TBST漂洗3次，10min/次，显影。
3 统计学方法
细胞活力、炎性因子的相关数据采用GraphPad Prism 5软件分析，Western blot实验的数据采用Image J 软件分析。通过SPSS 17.0软件进行统计学处理，数据以均数±标准差（±s）表示，各组间的差异采用单因素方差分析，两两比较使用LSD-t方法检验，当P＜0.05时认为具有统计学意义。
1 叶下珠抗炎的作用靶点
在HERB数据库中获得叶下珠的作用靶点共64个，如图1所示，其中P值越小，在图中的颜色越深，在GeneCards数据库中获得炎症的相关靶点共10498个，制作上述两者的韦恩图如图2所示，共得到49个交集靶点。
图1 叶下珠作用靶点
图2 叶下珠作用靶点与炎症相关靶点的韦恩图与交集信息
2 PPI分析与关键核心靶点筛选
将49个交集靶点导入STRING数据库进行初步的PPI分析，将结果导入Cytoscape 3.8.2软件进行可视化处理，如图3所示，其中包括41个节点，313条边，运用MCODE寻找最有意义的模块，利用Cyto-Hubba插件筛选得到10个关键核心靶点，包括丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）、白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死因子 （TNF）、白细胞介素-1β（IL1B）、白细胞介素-10（IL-10）、转录因子AP-1（JUN）、半胱天冬酶3（CASP3）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、细胞间粘附分子1（ICAM1）。
图3 交集靶点的PPI及关键核心靶点的筛选
3 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析
将上述获得的10个关键核心靶点导入Hiplot数据库进行GO、KEGG富集分析，对结果进行整理并绘制气泡图与柱状图，如图4所示，通过GO功能富集分析结果得出，在生物过程（biological processes，BP）上主要参与DNA结合转录因子活性的调节、脂多糖应答、细菌原分子应答、细胞对化学应激的应答等；
在分子功能（molecular function，MF）上主要参与细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体结合、信号受体激活因子的活性等；
在细胞组分（cellular component，CC）上主要参与膜转运、膜微区、膜区域等。
图4 GO功能富集分析、KEGG通路富集分析结果
KEGG通路富集分析结果显示，按P ＜0.05，共可富集到130条通路，包括NF-κB信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路等等，如图5。以上分析结果说明叶下珠可以参与细胞生物过程，调控相关的信号通路与途径来治疗炎症。
图5 关键核心靶点与KEGG通路富集结果网络（前18位）
4 AEP各浓度对RAW264.7细胞活力的影响
如图6所示，可以观察到0.0625mg/ml、0.125mg/mlAEP作用72h后，与空白对照组相比，在正常条件下对RAW264.7细胞的细胞活力无明显抑制作用，因此，后续实验浓度根据MTT结果选择AEP质量浓度为0.0625mg/ml、0.125mg/ml。
图6 AEP对RAW264.7细胞活力的影响
5 AEP对LPS刺激的RAW264.7细胞分泌NO的影响
如图7所示，与空白对照组相比，LPS组经过处理后，RAW264.7细胞的NO释放量显著升高；
然而与LPS组相比，AEP各组（0.0625mg/ml、0.125mg/ml）均能抑制NO释放量，由此可以得出结论，给药组能显著减少LPS诱导下RAW264.7细胞的NO释放量。
图7 AEP对RAW264.7细胞NO分泌的影响
6 Western blot检测经药物处理后胞浆NF-κB p65蛋白表达
如图8所示，与空白对照组相比，LPS组细胞胞浆内NF-κB p65蛋白表达显著降低（P＜0.01），然而与LPS组相比，AEP给药组能显著增加NF-κB p65在细胞胞浆中表达（P＜0.05或P＜0.01），由此可以得出结论，给药组能显著抑制胞浆中NF-κB激活进入细胞核中。
图8 AEP对胞浆NF-κB p65蛋白表达的影响
炎症是一种伴随多种疾病发生发展的病理现象，与恶性肿瘤[8]、代谢性疾病[9]、心血管疾病[10]、自身免疫性疾病[11]等疾病密切相关。炎症反应主要是由巨噬细胞介导，有研究表明，当巨噬细胞受到外界刺激时（如LPS）会释放一氧化氮（NO）等细胞因子，这些细胞因子可促进炎症反应的发生和导致组织损伤[12]。LPS是革兰阴性菌细胞壁主要组成成分之一，机体发生炎症反应的过程包括识别LPS与相关信号转导等。经过LPS刺激后，巨噬细胞会引起机体炎症反应，此时核转录因子κB（Nuclear Factor-kappa B，NFκB）信号通路是后续机体发生炎症反应的主要调控信号通路，因此NF-κB信号通路在LPS引起巨噬细胞反应与炎症细胞因子分泌等方面具有重要作用[13]。
本文通过网络药理学的分析方法，得到叶下珠抗炎的10个关键核心靶点，AKT1在LPS诱导的炎症模型中COX-2的表达起关键作用，并作为保持LPS刺激的RAW264.7细胞中氧化还原平衡的介质，是药物缓解炎症的潜在特异性靶点[14]；
IL-6、TNF、IL1B属于促炎细胞因子，在机体防御病原体和急性应激等方面发挥着关键的作用，促炎细胞因子可影响着各种人类疾病的发病机制，临床前和临床研究确定了IL-6、TNF、IL1B在炎症、癌症中的关键作用[15]；
IL-10是一种关键的抗炎介质，可保护宿主免受对病原体和微生物群的过度反应，同时在无菌伤口愈合、癌症和体内平衡等其他环境中发挥重要作用[16]；
JUN是转录因子家族的成员，有研究表明可通过影响JUN靶向控制IL-1β合成和巨噬细胞活化来调节炎症[17]；
CASP3是半胱氨酸-天冬氨酰蛋白酶家族的关键成员，在细胞凋亡过程中有着重要意义，它可作为一种凋亡调节因子，影响细胞中的蛋白质底物并诱导细胞的调亡[18]；
PPARG属于核受体超家族，作为转录因子调节细胞分化、发育和代谢，此外还涉及脂质代谢的调节，控制单核细胞/巨噬细胞的成熟和炎症反应应答[19]；
MAPK1从细胞外刺激到细胞内信号传导的关键靶点，作用于多条信号通路如NF-κB 信号通路，影响着细胞的增殖、凋亡、炎症反应等等[20]；
ICAM-1是一种细胞表面糖蛋白和粘附受体，调节白细胞从循环到炎症部位聚集，在上皮细胞和免疫细胞上被诱导以响应炎症刺激，ICAM-1在驱动炎症反应中的作用是公认的，是炎症、损伤消退和肿瘤发生中细胞反应的主要调节器[21]。
通过GO、KEGG富集分析对10个关键核心靶点所参与的生物学过程与相关信号通路进行预测，结果说明叶下珠可参与细胞生物过程与影响相关信号通路达到抗炎的作用。其中KEGG分析共得到130条信号通路，包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路等，上述信号通路可能是叶下珠抗炎的重要关键通路，且NF-κB信号通路是LPS引起巨噬细胞炎症反应的中心环节，因此我们侧重对NF-κB信号通路展开细胞实验进行进一步确证。
细胞实验采用不同质量浓度的AEP刺激RAW264.7细胞，MTT结果发现当AEP的浓度小于0.125mg/ml时，对RAW264.7细胞的细胞活力无显著影响且无促进细胞生长作用。
NO是一种不稳定的自由基，可由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸产生。在炎症刺激等情况下，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）可产生并诱导催化NO持续生成，造成的后果是过量的NO会促进炎症性疾病的发生和发展[22]。本实验采用ELISA法检测LPS和用不同质量浓度的AEP（0.0625mg/ml、0.125mg/ml）干预24h后发现，AEP各质量浓度组均能有效抑制LPS组NO的释放。
NF-κB是早期核转录因子，可调控炎症反应各阶段的许多分子。在没有外界刺激时，IκB在细胞质中结合NF-κB形成复合体，掩盖NF-κB的核定位信号，在受到外界刺激时，通过IκB激酶（IKK）复合物被激活，磷酸化IκB，使NF-κB与IκB从结合状态解离，释放NF-κB二聚体，进入胞核与DNA中的特异性位点结合来调节基因转录[23]。Western blot实验证明，RAW264.7细胞受到LPS刺激后，NF-κB p65蛋白在细胞胞浆内的表达明显降低，说明NF-κB从胞浆转移至细胞核内；
而经不同质量浓度的AEP组（0.0625、0.125mg/mL）作用细胞后，均能增加胞浆内NF-κB p65蛋白的表达（P＜0.05或P＜0.01），可以抑制NF-κB的激活阻止转移到细胞核中，证明AEP可以通过作用于NF-κB信号通路发挥抗炎效应，进而发挥对炎症相关性疾病的治疗作用。
综上所述，本研究通过网络药理学初步探索叶下珠抗炎的具体作用靶点与机制，并结合细胞实验验证AEP可通过作用于NF-κB信号通路发挥抗炎效应，为叶下珠治疗炎症相关性疾病的开发与利用提供了初步的理论依据。
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