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陈 勇， 何冬雷， 周江浩， 梁月祥， 杨 丞
(海南医学院第一附属医院， 海南 海口 570102)
胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，其发病率在全球范围内不断增加。目前手术是根治胃癌的最佳方法，但患者治疗后的存活率仍然很低[1]。大多数患者在诊断时已处于中晚期，错过了最佳的治疗时机，因此探索新的胃癌治疗靶点对于胃癌的治疗至关重要。Numb1蛋白是一种能够抑制肿瘤恶性转化的衔接蛋白，在细胞分化过程中起关键作用。Numb1基因在多种肿瘤细胞中表达上调，并可能与癌细胞转移及耐药的形成相关。ITGB1是介导细胞粘附、收缩性和运动性的细胞表面粘附分子，可促进上皮细胞的扩散和迁移。研究发现，ITGB1的高表达介导了非小细胞肺癌的发展[2]。也有研究已经证实，ITGB1在胃癌患者中表达量增加[3]。目前发现衔接蛋白 Numb1可能参与调节 ITGB1影响细胞骨架的形成，但是具体的分子机制尚不清楚。综上所述，Numb1与ITGB1在肿瘤增殖、迁移以及耐药过程中有不可忽视的作用，二者之间是否存在相互作用共同促进胃癌的发展有待进一步研究，其可能存在的结合位点也尚未得到验证。本研究拟通过胃癌临床标本及胃癌细胞株，分析Numb1对ITGB1的调节作用，研究Numb1与ITGB1的相互作用对胃癌细胞迁移及侵袭力和耐药性的影响，明确Numb1是否通过ITGB1实现对胃癌细胞转移及耐药的调节，为胃癌患者的提供可能的治疗靶点。
1.1材料：选取2019年2月至2021年6月手术切除的胃癌及其癌旁组织21例。手术取材后立即置于液氮冷冻，保存于-80℃冰箱。所有患者均已签署知情同意书。人胃癌细胞BGC-823购自中科院上海细胞库；
奥沙利铂(国药准字H20093541)购自江苏红豆杉药业有限公司；
RPMI 1640培养基、胰酶消化液、胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；
免疫沉淀试剂盒购自赛默飞公司；
过表达Numb1、ITGB1的重组慢病毒液和阴性对照重组慢病毒购自上海吉满生物科技有限公司；
si-NC、si-ITGB1、si-Numb1购自苏州贝信公司；
LipofectamineTM2000转染试剂及BCA蛋白定量试剂盒购自美国Invitrogen公司；
2×SYBR Green qPCR MasterMix购自北京索莱宝科技有限公司；
Numb1、ITGB1和GAPDH抗体购自英国Abcam；
CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；
Transwell小室购自中国Corning公司。
1.2方 法
1.2.1细胞培养：使用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基培养胃癌细胞株BGC-823，置于37℃、5%CO2恒温的细胞培养箱中，根据细胞生长密度更换新鲜的培养基，待细胞生长融合度到达80%～90%时进行消化和传代，取对数生长期的细胞进行下一步的实验。
1.2.2慢病毒转染实验：将对数期生长的BGC-823细胞接种于6孔板(5×105个/孔)，继续培养过夜后，将细胞随机分为flag-NC组(转染flag-NC)、flag-Numb1组(转染flag-Numb1)、flag-ITGB1组(转染flag-ITGB1)。根据MOI值计算每孔所需病毒量[病毒体积=(MOI×细胞数)/病毒滴度，病毒滴度=2×108TU/mL]。每孔加入2.5μL聚凝胺(2mg/mL)，然后加入无血清培养基补充体积至1mL/孔。24h后，更换含嘌呤霉素的培养基筛选。72h后，收集细胞进行后续实验。
1.2.3细胞转染实验：将BGC-823细胞分为si-NC组、si-ITGB1组、si-Numb1组。按照LipofectamineTM2000说明书步骤进行转染。调整BGC-823数量并接种于6孔板，使用不含抗生素的完全培养基培养，使转染时细胞达70%左右生长密度。制备si-Notch1、si-Numb1与脂质体的复合物，同时制备无干扰作用的si-RNA(si-NC)与脂质体复合物，将复合物加入6孔板相应si-NC组、si-ITGB1组、si-Numb1组的孔内，摇动混合，5～6h将细胞培养基倒掉，PBS洗涤细胞2次，更换为RPMI 1640培养基，24h后更换培养液。
1.2.4qRT-PCR法检测细胞中Numb1、ITGB1的表达：TRIzol试剂提取各组细胞中的总RNA，酶标仪检测总RNA的纯度和含量。按照qRT-PCR试剂盒实验说明，依次进行逆转录和qRT-PCR实验。qRT-PCR反体系：cDNA模板2ng，上下游引物各0.4μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5μL，ddH2O补充至10 μL。qRT-PCR反应条件：95℃(30s)预变性后，变性95℃(7s)，退火55℃(30s)，72℃(15s)，40个循环周期。扩增结果根据2-△△Ct法计算mRNA的相对表达量。qRT-PCR引物序列：GAPDH-F，5-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3，GAPDH-R，5-GCAGCTCAGTAACAGTCCGC-3；
Numb1-F，5-AGGCTTCTTTGGAAAAACTGGA-3,Numb1-R，5-CGGGTGCTAGAGCAGTATGG-3；
ITGB1-F，5-CGCCGCGCGGAAAAGATG-3，ITGB1-R，5-AAACACCAGCAGCCGTGTAA-3。
1.2.5WB法检测细胞中Numb1、ITGB1的表达：收集各组胃癌细胞，向细胞中加入RIPA裂解液裂解细胞。收集细胞上清液并测定其蛋白浓度。取30μg样品进行SDS-PAGE电泳和转膜操作。使用5%脱脂奶粉室温孵育2h以去除非特异性结合位点。加入Numb1抗体(1∶1000)、ITGB抗体(1∶2000)，于4℃条件下孵育过夜。加入特异性二抗(1∶5000)，室温条件下孵育1h后，凝胶成像系统检测蛋白条带。Image J软件分析各蛋白条带的灰度值。
1.2.6免疫共沉淀实验检测胃癌细胞中Numb1和ITGB1结合情况：将flag-NC、flag-ITGB1、flag-Numb1三组BGC-823细胞扩增至100mm细胞培养皿中。待细胞密度至70%以上时，细胞刮刀收集细胞并加入含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液，裂解20min。12000g离心10min后取收集上清。在flag抗体与Protein G磁珠中加入上清液共孵育过夜。隔天依次将flag结合蛋白洗脱至新的EP管。加入SDS上样缓冲液，100℃煮10min。上述样品用12%的SDS-PAGE电泳，并进行WB分析。
1.2.7CCK8细胞毒性试验：用0.25%胰酶消化对数生长期的细胞后离心，用含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基稀释成单细胞悬液，接种到96孔板中，调整细胞浓度至8000个/孔，在37℃ 5% CO2培养箱中培养，在培养至24h、48h时每孔加入20μL CCK8溶液，2h后用酶标仪测定在450nm吸光度(A)值。
1.2.8细胞划痕实验：各组细胞培养24h，使用胰蛋白酶消化，将密度调整为1×105个细胞/孔平铺于6孔板上。每组设置3个平行孔。使用200μL无菌枪头轻轻划过6孔板，每次平行划5次左右。将处理后的6孔板置于37℃恒温培养箱中培养48h，PBS冲洗3次。在倒置显微镜下观察划痕闭合度。通过Image J系统检测细胞迁移面积。
1.2.9Transwell细胞侵袭实验：取50μL基质胶铺于8μm Transwell小室内，37℃培养箱静置1h。取各组细胞，胰酶消化后离心，后用无血清RPMI 1640培养基重悬细胞并计数，调整细胞数至2×104/mL，接种于Transwell小孔上室，每孔200μL。下室加入500μL含10%血清的DMEM培养基，培养24h。取出Transwell小室，用4%的多聚甲醛固定15min，0.1%结晶紫染色20min，PBS清洗后在倒置显微镜下随机选取10个视野的细胞进行计数。
2.1胃癌肿瘤组织中Numb1和ITGB1表达水平比较：采用qRT-PCR检测胃癌肿瘤组织中Numb1和ITGB1表达水平，结果显示与癌旁组织比较，肿瘤组织中Numb1和ITGB1表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1A。此外，相关性分析结果显示，Numb1和ITGB1的表达水平成正相关(r=0.6270)见图1B。
图1 胃癌组织Numb1和ITGB1表达水平比较
2.2Numb1与ITGB1蛋白在胃癌细胞中相互结合：通过免疫共沉淀实验检测胃癌细胞中Numb1和ITGB1结合情况，结果显示，全细胞裂解液中，与flag-NC比较，过表达flag-ITGB1组Numb1蛋白表达水平增加；
过表达flag-Numb1组Numb1蛋白表达水平增加，说明过表达稳转细胞系构建成功。在过表达flag-Numb1的flag免疫沉淀产物中可检测到ITGB1蛋白，在过表达flag-ITGB1的flag免疫沉淀产物中可检测到Numb1蛋白，而在过表达flag-NC的flag免疫沉淀产物中均不能检测到Numb1和ITGB1蛋白。结果说明Numb1与ITGB1蛋白之间存在直接或间接的相互作用，见图2。
图2 免疫共沉淀检测胃癌细胞Numb1和ITGB1结合情况
2.3Numb1在胃癌细胞中调控ITGB1表达：qRT-PCR和WB结果显示，与si-NC组比较，si-Numb1组Numb1的mRNA和蛋白表达水平降低；
与si-NC组比较，si-ITGB1组ITGB1的mRNA和蛋白表达水平降低，说明siRNA转染成功。与si-NC组比较，si-Numb1组ITGB1的mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)，而si-ITGB1组Numb1的mRNA和蛋白表达水平无显著性变化(P>0.05)，见图3A和3B。
图3 siRNA干扰实验研究Numb1与ITGB1表达调控关系
2.4沉默Numb1和ITGB1抑制在胃癌细胞增殖：CCK8实验结果显示，与si-NC组比较，si-Numb1组和si-ITGB1组细胞增殖能力降低，在72h时表现出统计学差异(P<0.05)，见图4。
图4 CCK8检测沉默Numb1和ITGB1对胃癌细胞增殖能力影响
2.5沉默Numb1和ITGB1抑制在胃癌细胞迁移和侵袭：细胞划痕实验结果显示，与si-NC组比较，si-Numb1组和si-ITGB1组细胞24 h迁移率均降低，差异有统计学差异(P<0.05)，见图5。Transwell细胞侵袭实验结果显示，与si-NC组比较，si-Numb1组和si-ITGB1组细胞侵袭数目均降低，差异有统计学差异(P<0.05)，见图6。
图5 细胞划痕实验检测沉默Numb1和ITGB1对胃癌细胞迁移能力影响
图6 Transwell检测沉默Numb1和ITGB1对胃癌细胞侵袭能力影响
2.6沉默Numb1和ITGB1促进奥沙利铂对胃癌细胞的杀伤能力：CCK8实验结果显示，与si-NC组比较，si-Numb1组和si-ITGB1组经不同浓度(10、20、50、100μmoL/L)奥沙利铂处理胃癌细胞后，细胞存活率均降低，在(150、100μmoL/L)浓度下具有显著性差异(P<0.05)，见表1。
表1 不同浓度奥沙利铂对各组胃癌细胞存活率的影响
据国际癌症研究机构编制的2018年全球癌症发病率和死亡率估算数据统计，胃癌发病率为5.7%，死亡率为8.2%，是世界范围内第三大癌症相关死亡原因。胃癌细胞的复发转移及多药物耐药是化疗成功的主要障碍，其结果是肿瘤细胞对药物治疗的敏感性降低且极易复发。
Numb蛋白首先在果蝇中被鉴定和研究，是一种与细胞内膜相连的磷酸酪氨酸结合域蛋白。Numb又称细胞命运决定因子，在细胞分裂、细胞粘附和细胞迁移中发挥重要的作用[4]。最新的研究发现了Numb家族蛋白与肿瘤进展相关，Numb可与p53、Notch等相互作用以调节它们在肿瘤过程中的活性。例如Numb6可诱导胚胎转录因子Slug的表达，进而主动抑制E-钙粘蛋白，促使细胞进行上皮间质转化，导致乳腺癌细胞失去其上皮表型，表现出促迁移和促侵袭行为[5]。Numb1是Numb的一个亚型，大多数研究已将Numb1确定为一种肿瘤抑制因子，在结直肠癌和非小细胞肺癌中经常被下调[6]，然而也有研究发现，在食管鳞状细胞癌患者中，Numb的高表达与肿瘤高复发率和较差的总体术后生存率显著相关，敲除食管鳞状细胞系中的Numb1时，caspase-3依赖性细胞凋亡和细胞增殖抑制持续增加，癌症干细胞标志物表达下调，这表明Numb1可能促进癌症的发展[7]。但是Numb1在胃癌中的作用尚缺乏相关报道。在本实验中，我们发现与癌旁组织比较，肿瘤组织中Numb1表达水平升高。说明Numb1可能参与胃癌的发展。
整合素参与细胞-基质间相互作用以及癌细胞的迁移和转移，通过直接与上皮细胞间充质基质成分结合并提供细胞运动和侵袭所需的牵引力，在调节细胞增殖、运动以及迁移能力方面发挥着重要作用。ITGB1是主要的整合素β亚基，被称为癌症预后不良的潜在标志物[8]。Oshita等[9]的研究发现，ITGB1可通过形成各种α2β1、α3β1、α6β1和αvβ1整合素来促进细胞迁移和侵袭，从而促进小细胞肺癌的发展。在胃癌患者的肿瘤组织中，ITGB1的表达上调，能够增强细胞迁移率和增殖能力，而沉默ITGB1可以逆转这种作用。本实验结果与以往所述一致，与癌旁组织比较，肿瘤组织中ITGB1表达水平升高，ITGB1可能促进胃癌的发展。
已有研究显示，Numb通过其PTB结构域与ITGB1相互作用，调节ITGB1的内化从而影响细胞骨架形成。Martinez-Morales[10]等研究团队利用酵母双杂交实验也证明Numb的PTB结构域可以与ITGB1发生相互作用，并且能够调节ITGB1在细胞中的内化转运作用。在本实验中，我们发现ITGB1与Numb1的表达量呈正相关性，通过免疫共沉淀实验我们证实了Numb1与ITGB1蛋白之间存在直接或间接的相互作用。当沉默Numb1后ITGB1的表达下调，但是沉默ITGB1不会影响Numb1的表达，这表明Numb1可在胃癌细胞中调控ITGB1表达。癌细胞迁移和侵袭的能力使其能够改变组织内的位置并脱离原发性肿瘤，从而实现转移，因此抑制癌细胞的迁移和侵袭对于癌症的治疗至关重要。我们发现，当沉默Numb1与ITGB1后胃癌细胞的迁移与侵袭能力均下降，说明沉默Numb1与ITGB1可能通过抑制癌细胞的迁移与转移来抑制癌症的发展。
多药物耐药(Multi-drug resistent,MDR)是导致胃癌不可治愈的重要原因,奥沙利铂是晚期胃癌治疗的一线药物，而对其的耐药性是导致临床治疗失败的主要问题[11]。胃癌细胞中细胞周期改变和细胞凋亡信号通路信号活化的改变以及细胞骨架改变是胃癌耐药发生的主要机制。ITGB1的作用可导致p27Kip1在胞内累积，引起细胞周期异常是导致耐药的重要原因，这些生物学事件共同促进肿瘤细胞对化疗药物产生抵抗作用。在本实验中，我们发现沉默ITGB1会促进奥沙利铂对胃癌细胞的杀伤能力，而同时沉默Numb1和ITGB1将进一步加强药物对癌细胞的杀伤作用，表明抑制Numb1和ITGB1会降低肿瘤细胞对于抗癌药物的耐药性。
综上所述，我们的研究结果进一步揭示了胃癌细胞转移及耐药发生发展的具体生物学过程，并且确认Numb1在胃癌细胞转移及耐药形成过程中的重要作用。这一发现也将为解决胃癌的临床复发转移及耐药提供新的理论依据。
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