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韩 欢，王康锋，李明襄，管秀菊，张立娟△
(1.山东中医药大学，山东 济南 250014；
2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014)
近年来，人口老龄化现象日趋严重，老年慢性疾病发病率日益增长，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种退行性的慢性老年性中枢神经系统疾病，在中医理论中被称为“痴呆”，此病名最早见于唐代孙思邈所著的《华佗神医秘传·华佗治痴呆神方》，中医学认为“痴呆”是由老年髓海空虚、神机失用及痰瘀阻络所致的一种神志异常的疾病，发病部位在脑，涉及心肾[1]。临床上表现为记忆力丧失、语言和认知障碍和人格改变等，并且这些改变呈现出进行性加重的趋势，还可伴有焦虑抑郁等情绪[2]。AD不仅严重降低了患者的生活质量，也使家庭和社会承担着极大的精神压力与经济负担。目前国际上公认的关于AD的病理变化包括：β-淀粉样蛋白(Aβ)在神经细胞外沉积形成的神经炎性斑；
Tau蛋白过度磷酸化和聚集导致的神经元纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFT)；
神经元损伤、凋亡及一系列细胞炎症反应。多项研究表明，针刺能有效地改善AD的症状，其效果优于西药，具有多靶点、多层次、安全性高与副作用小的优势，已成为临床中治疗AD的重要手段[3-4]。本研究以近年来针刺通过调控与糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)相关的信号通路治疗AD的研究进展为着眼点，为探讨针刺治疗AD的作用机制提供科学依据。
糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase 3,GSK-3)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其广泛表达于哺乳动物真核细胞内，与细胞分化、炎症反应和胚胎发育等生理病理过程密切相关[5]。
糖原合成酶激酶(GSK-3β)是GSK-3的一种异构体形式，富集于中枢神经系统，尤其在海马组织中表达丰富，是对记忆学习能力至关重要的信号分子。GSK-3β发挥生物学作用主要通过3种方式：磷酸化调节、结合蛋白调节以及细胞内定位调节[6]。GSK-3β的活性受磷酸化调控，其氨基端的负性调节因子第9位丝氨酸(Serine-9)磷酸化后，GSK-3β的活性受到抑制；
而当其正性调节因子第216位酪氨酸残基(Tyrosine-216)被激活磷酸化时，GSK-3β的活性提高，并对神经系统中的突触造成损伤，从而引发多种中枢神经系统退行性疾病，如脑梗死、阿尔茨海默病与帕金森病等[7-8]。研究中发现，GSK-3β可以通过调控细胞内多条信号通路，干预Aβ的沉积、Tau蛋白过度磷酸化、神经细胞凋亡及细胞炎症反应等参与AD的发病机制[9]。
2.1 GSK-3β与Aβ的生成
Aβ沉积是AD发病过程中最重要的病理特征，而GSK-3β的活性增加可以促进Aβ的生成和沉积，Aβ的异常聚集反过来也可以增加GSK-3β的活性，进而加剧AD的病理发展。Aβ是由β-淀粉样蛋白前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)水解而来，APP的水解途径主要有：淀粉样蛋白水解和非淀粉样蛋白水解。GSK-3β对APP及其分解过程中的关键酶α、β和γ均具有重要的调控作用。在淀粉样蛋白生成途径中。首先，β分泌酶(BACE1)将APP切分，然后APP的底物早老蛋白-1(Presnilin-1,PS1)调控γ分泌酶的活性，释放出Aβ40或Aβ42，促使脑中Aβ的生成[10]。研究表明[11]，当GSK-3β的活化水平被抑制时，BACE1基因的转录和表达水平也随之下降，由BACE1介导的 APP水解水平下降，则Aβ的水平也随之下降，大鼠记忆缺陷得到改善。亦有研究证实，GSK-3β的抑制剂锂通过抑制GSK-3β可保护大鼠海马神经元免受Aβ的损伤，保护大脑神经功能[12-14]。由此可见，GSK-3β的活化水平在Aβ形成和积聚的过程中尤为关键。
2.2 GSK-3β与Tau蛋白过度磷酸化
Tau蛋白是中枢神经系统中稳定神经元细胞结构和轴突运输的微管相关蛋白，Tau蛋白的活性受磷酸化和去磷酸化的调节。Tau蛋白的磷酸化受到多种蛋白激酶和磷酸酶的控制，GSK-3β是促使Tau蛋白磷酸化的关键激酶，与Tau蛋白的多个位点磷酸化密切相关[15]。蛋白磷酸酯-2A(Protein phosphatase 2A,PP2A)是一种多效磷酸酯酶，可以使脑内Tau蛋白去磷酸化。因此，PP2A与GSK-3β的平衡失调会造成Tau蛋白过度磷酸化。假如Tau蛋白过度磷酸化，神经元骨架微管蛋白的稳定性就会遭到破坏，聚合成双螺旋纤维(Paried helical filaments,PHF)，进而形成神经原纤维缠结(NFT)，异常Tau蛋白磷酸化沉积会影响轴突的运输功能，阻碍脑神经营养功能，最终触发凋亡信号导致神经元凋亡，引发AD[16]。临床上通常把Tau蛋白上的Thr181、Thr231、Ser199和Ser396等关键磷酸化位点持续不断地磷酸化视为轻度认知功能障碍(Mild cognitive impairment, MCI)向AD发展变化的信号[17]。相关报道指出，Tau蛋白在AD患者脑内磷酸化水平高出正常人3～4倍[18]。
2.3 GSK-3β与细胞炎症反应
细胞炎性反应也是AD发病的重要机制之一，GSK-3β是炎症反应中的关键激酶[19]。其参与调控与炎症反应密切相关的NF-κB、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)等下游底物，促使多种促炎细胞因子的产生。当GSK-3β处于活化状态时，它可以促使NF-κB上的REL-A(p65)和B淋巴细胞瘤3蛋白(BCL-3)进行磷酸化反应，磷酸化后的BCL-3与NF-κB上的NF-κB1(p50)和NF-κB2(p52)的DNA结合成三聚体，诱发细胞的炎症反应[20]。白细胞介素10(Interleukin-10，IL-10)是主要的抗炎因子之一，其作用是抑制环氧化酶2(Cyclooxygenase-2,COX2)、IL-1β和白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)的表达，控制感染和炎症，而GSK-3β可以通过PI3K/AKT/GSK-3通路减少CREB核转位、抑制IL-10的表达[21]。有学者发现[22]，对AD模型大鼠给予GSK-3β抑制剂时，GSK-3β和GSK-3β-Tyr16的活性被抑制，可以减少炎性反应，保护神经元，亦证实了GSK-3β参与细胞炎症反应的发生。
2.4 GSK-3β通过调控信号通路影响AD
2.4.1 GSK-3β调控Wnt信号通路 经典Wnt信号通路的组成因子有Wnt蛋白、卷曲蛋白、蓬乱蛋白(DSH)、β-连环蛋白(β-catenin)与GSK-3β等[23]，β-catenin是一种多功能信号蛋白, 其参与基因的表达, β-catenin的磷酸化水平对Wnt信号通路的完成起着重要作用。Wnt蛋白产生于海马星形胶质细胞中，是β-catenin信号通路上的始动因子，DSH与其结合后被激活，且下游蛋白质复合物GSK-3β被抑制。GSK-3β在Wnt信号通路中扮演重要角色，是重要的负性调节因子，参与组成泛素蛋白酶，分解β-catenin，使其保持在较低的水平，当GSK-3β的活性被抑制时，β-catenin进入细胞核，与转录因子结合启动下游靶基因的转录。Wnt蛋白失活时，β-catenin磷酸化水平受GSK-3β的直接控制，并通过蛋白酶体途径被降解，加重因Wnt/β-catenin信号转导中断导致的中枢神经系统的毒副作用，Wnt蛋白激活时，其与卷曲蛋白受体等结合，破坏GSK-3和支架蛋白Axin等形成的复合体，稳定β-catenin结构，促进Wnt靶基因表达[24]。GSK-3β可通过Wnt信号通路有效地调控神经细胞的分化和凋亡，GSK-3β的活性被经典Wnt信号通路通过一系列的磷酸化抑制，从而阻止β-catenin的磷酸化[25]。De Ferrari GV等[26-27]研究发现，Wnt信号通路活性丧失时，GSK-3β被激活，β-catenin被破坏，最终导致Aβ聚集损伤神经元。
2.4.2 GSK-3β调控PI3K/AKT/GSK-3β信号通路 PI3K/AKT/GSK-3β信号通路广泛表达于各类细胞内，干预细胞的增殖和凋亡，该通路中的主要因子有NF-κB、CREB及AKT/PKB等，GSK-3β是最早发现的AKT的直接底物，细胞凋亡由PI3K/AKT信号通路的下游蛋白GSK-3β调节Mcl-1磷酸化水平所诱发[28]。磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)是PI3K被激活时的产物，其与AKT的PH域结合，Ser473和Thr308位点磷酸化，随后AKT被激活，PI3K/AKT/GSK-3β通路上的效应靶点蛋白GSK-3β与活化的AKT结合后，其氨基端的丝氨酸残基9位点(Ser9)发生磷酸化，致使GSK-3β失活，导致转录因子、CREB、信号转导和转录激活因子1被激活，进而使下游底物如NF-κB和Tau蛋白的活性受到影响[29]。GSK-3β失活后，则不会诱发Tau蛋白磷酸化造成神经纤维缠结，因此也就无法引发AD[30]。相关研究也已证实，AD患者脑中的PI3K/AKT信号确实比常人轻微[31]。研究已表明，Aβ寡聚体可以使GSK-3β活化，进一步抑制PI3K/AKT信号通路的活性，致使Tau 蛋白过度磷酸化引发AD[32]。
经络辨证分析，AD与督脉、肾经密切相关，督脉是联系肾、髓和脑的关键通路，故临床研究中针刺治疗AD通常采取“益肾调督”“通督启神”疗法，选用百会、四神聪、神门、太溪、足三里及神庭等腧穴，目前针刺治疗AD多从调节相关蛋白、神经递质以及信号通路等作为切入点，研究针刺干预后是否达到保护神经元的效果，由此，循证研究[33]结果表明，针灸治疗AD具有疗效更显著、安全性高和成本较低的优势，针刺治疗AD的疗效受到国内外研究者的广泛关注、研究和认可。大量实验研究证明，针刺通过调控与GSK-3β有关的信号通路，可以起到抑制Aβ沉积、改善Tau蛋白过度磷酸化、修复神经元损伤以及调节神经细胞炎性反应的作用，从而改善AD症状、延缓AD进程，现总结其作用机制如下。
3.1 针刺调控Wnt/β-catenin信号通路
中枢系统中GSK-3β在调节大脑中Tau蛋白过度磷酸化有重要作用，其活性增加可诱导Tau蛋白磷酸化，而GSK-3β是Wnt通路的关键调节蛋白，故针刺调控Wnt/β-catenin可能是延缓AD进程的重要机制。
杨杨[34]的研究表明，在对AD模型大鼠进行智三针干预，针刺神庭及双侧本神穴后，大鼠的学习和记忆能力明显改善，智三针可以增强GSK-3β的磷酸化，减少GSK-3β的表达量，从而抑制了GSK-3β对β-catenin的磷酸化作用，核β-catenin含量升高，同时智三针也上调了LRP5、LEF1的含量，均可以加快Wnt/β-catenin信号通路的转导，进而使p-tau(s396)和p-tau(s404)的水平降低，减少Aβ的沉积，达到改善AD模型大鼠学习记忆能力和空间学习的作用。王颖及其同组研究人员[35-38]在研究中发现，通过针刺干预AD大鼠的百会、肾俞穴后，AD模型大鼠海马区和皮质组织的GSK-3β和GSK-3β-tyr16表达量明显减少，GSK-3β-ser9表达量明显增多，GSK-3β活性被抑制，AD模型大鼠大脑皮层、海马和内嗅皮层的Wnt表达显著增强，随之DSH被激活，激活的DSH抑制Axin-Apc-GSK-3β复合物的形成, 提高PP2A的表达，从而抑制β-catenin磷酸化，防止Aβ的过度沉积和Tau蛋白的异常聚集，促进突触结构修复，延缓脑细胞衰老，达到预防脑损伤的作用。证实了针刺可以抑制GSK-3β的活性，激活Wnt通路，达到延缓AD进程的目的。于学平等[39]对大鼠模型组进行百会透刺曲鬓穴的针刺疗法，旨在贯通督脉、胆经和膀胱经，统调一身之阳气，针刺后的大鼠行为功能得到一定恢复，神经缺损症状减轻，其机制可能是通过上调Wnt3a、β-catenin的表达、抑制GSK-3β蛋白水平和GSK-3βmRNA的表达来激活Wnt通路，促进神经干细胞的生殖分化，改善神经功能。俞萍等[40]通过针刺督脉腧穴长强干预模型大鼠,发现大鼠海马区Wnt通路上的β-catenin蛋白表达下调、GSK-3β表达上调, 从而调节Wnt通路，使得大鼠的学习记忆能力得到明显改善。Wnt信号通路可以调节发育过程中的细胞增殖分化以及成人神经系统中的突触功能，其通路上的负性调节因子GSK-3β水平是与AD相关的神经变性中的重要因素，以上研究均表明针刺可以通过调控Wnt/β-catenin信号转导过程中的关键激酶GSK-3β的活性来达到防治AD的目的。
3.2 针刺调控PI3K/AKT/GSK-3β信号通路
PI3K/AKT信号通路与学习记忆能力与认知水平密切相关，可以促进大鼠海马齿状回的神经再生并调节突触的可塑性[41]。GSK-3β作为该通路下游主要底物蛋白，通过针刺使其活性被抑制时，可以阻止细胞凋亡从而防治AD。唐银杉[42]研究发现，针刺AD模型SAMP8小鼠的百会、印堂与水沟穴后，免疫组织化学法(HIC)显示，电针组小鼠海马CA1区P-AKT(Ser473)、GSK-3β(Ser9)磷酸化增高，GSK-3β活性降低，P-Tau(Ser199/202)蛋白含量明显降低，减少NFTs。其机制为电针通过上调PIK/AKT信号转导通路促进AKT磷酸化，进一步促进GSK-3β的Ser9位点发生磷酸化，抑制GSK-3β的活性，降低Tau蛋白过度磷酸化，从而保护神经元，达到治疗AD的目的。针刺还可以上调富集于海马区的CA2、CA3和对认知、学习记忆能力都有重要作用的脑源性神经营养因子(BDNF)以及CREB的水平，增强细胞增殖和神经可塑性，通过激活PI3K/AKT通路，抑制GSK-3β的活化程度，减少PP2A催化亚基磷酸化，提高PP2A活性，降低Tau蛋白磷酸化，从而减少细胞凋亡，改善大鼠行为[43]。研究发现，经过针刺肾俞、内关、百会、足三里和三阴交后的大鼠，在MWM评估后，认知和记忆功能明显高于非电针组大鼠，表明针刺能调节AD模型大鼠中枢海马区PI3K通路的信号转导，使得IRS1、IRS2、IDE和GSK-3β蛋白水平显著升高，而PI3K-p85α和AKT水平降低，胰岛素抵抗的情况得到改善，进而海马中Aβ的含量降低，同时Tau蛋白的磷酸化得到调节[44]。Wang Y等[45]通过研究发现，“嗅觉三针”可以激活PI3K/AKT信号通路，进而抑制GSK-3β的活性，Tau蛋白磷酸化被抑制，达到改善AD模型大鼠大脑突触可塑性和提高神经元存活率的目的。刘勇等[46]的研究内容为针刺对脑组织中p-GSK3β的影响研究，方法是针刺大鼠的百会、双侧风池等穴位，结果表明针灸能抑制模型大鼠脑组织中PTEN蛋白的表达，增强PI3K/AKT/GSK-3β通路的转导，并通过增加AKT的磷酸化减少GSK-3β的活性，对损伤的神经元进行修复和再生。高晶等[47]研究表明电针刺激处理可以激活PI3K/AKT/GSK-3β信号通路，使脑组织p-AKT和AKT的蛋白表达升高，从而抑制GSK-3β的活性，阻止细胞凋亡的发生。以上研究均表明针刺可以通过激活PI3K/AKT信号通路、抑制GSK-3β的活性，达到防止细胞损伤、促进神经元修复和治疗AD的作用。
3.3 针刺调控GSK-3β/mTOR信号通路
相关文献[48]报道，对AD模型大鼠的百会穴、肾俞穴进行针刺干预后，模型大鼠海马、中缝背核区GSK-3β及GSK3β-pTyr216的相对表达量明显降低，GSK-3β-pSer9相对表达量明显增多，认知功能得到改善。其机制可能是预电针和预针刺抑制AD模型大鼠中缝背核区GSK-3β基因的转录和表达，从而抑制GSK-3β/mTOR通路，进而抑制Tau蛋白过度磷酸化和NFTs的沉积。
3.4 针刺调控PTEN/AKT/GSK-3β信号通路
针刺足三里穴和曲池穴可以通过调节PTEN/AKT/GSK-3β信号通路、下调PTEN磷酸化水平，从而抑制AKT在Thr308位点的激活，促进AKT在Ser473位点的活化，使得p-PDK1和p-GSK-3β表达水平明显提高，进而减少脑神经细胞的死亡，提高神经元细胞存活率，改善AD症状，延缓AD进程[49]。
阿尔茨海默病给患者及其家属身心都带来极大的不便与痛苦，是多年来研究的热点。综上所述，GSK-3β在大脑所有部位均有分布，影响着多种神经系统疾病的发生发展，GSK-3β的活化水平与慢性退行性神经系统疾病AD的发生密切相关。针刺作为现今被各界广泛研究和认可的外治法，具有安全无副作用的优点，针刺疗法在现代理论研究中证实了其在改善AD病情方面具有显著优势，其可以通过调节GSK-3β蛋白磷酸化抑制Aβ的异常积聚、Tau蛋白过度磷酸化、细胞凋亡、炎症反应与改善胰岛素抵抗状态等AD典型病理改变，从而延缓AD进程。故本研究推论针刺可能通过调节多条信号通路中的关键分子GSK-3β的表达水平达到治疗AD的效果。
虽然针刺通过调控GSK-3β在改善AD症状方面起了重要作用，但在许多方面仍需进一步探讨：阿尔茨海默病复杂的病因和不确切的发病机制，对疾病的诊断和临床治疗有一定的影响，使其至今仍缺乏一种有效的治疗手段；
目前关于治疗AD的研究大多是关于发病机制的假说，临床药物均存在着治疗靶点较单一的局限性；
针刺调节GSK-3β治疗阿尔茨海默病的研究才刚刚起步，其机制也缺乏直接可靠的依据，临床试验方面还需要做更多具体深入的研究。因此，找到一种多靶点、多路径有效防治AD的方法显得尤为迫切，研究针刺通过调控GSK-3β改善AD的症状为针刺治疗AD提供了一个新的角度，相信随着医学技术的不断进步，对针刺调节GSK-3β改善AD作用机制的不断深入探索研究，未来GSK-3β有望成为治疗AD重要的针刺靶点。
