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贾晓冬，汲珊珊，刘 蕊，楚玉兰
(1.天津医科大学研究生院 300070；
2.天津医科大学人民医院临床学院 300121；
3.天津金域医学检验实验室有限公司 300392)
运用流式细胞术检测淋巴细胞亚群(LS)观察机体细胞免疫水平，了解在不同疾病状态下患者的细胞免疫功能状态，对恶性肿瘤、自身免疫性疾病、免疫缺陷病、血液系统疾病的诊治、预后判断均具有重要意义[1-5]，已在临床得到广泛应用。但传统流式细胞术人工分析主要依靠分析者手动圈门和荧光表达强度的判读，检测灵敏度和准确性取决于分析者经验[6-7]。近年来，随着人工智能(AI)技术在医疗领域的探索与发展，AI辅助多参数流式细胞术(MFC)可通过聚类、降维、自动分群等分析方法自动判断并进行统计分析，实现对待测细胞群的分类和快速判定，提高了检测的灵敏度和准确性[8]。本研究应用人外周血LS流式检测数据建立了AI模型，并评价了AI辅助MFC检测LS免疫表型与人工分析结果的一致性，现报道如下。
1.1 一般资料
选取2020年6-7月天津金域医学检验实验室收集的1 263例患者外周血样本作为研究对象，其中男588例，女675例；
年龄0～81岁，中位年龄55岁。
1.2 方法
1.2.1实验步骤
采用美国BD公司FACS canto型流式细胞仪，检测用单克隆抗体购自同生时代公司，溶血素购自美国BD公司。按文献[9]步骤操作进行样本制备，荧光素标记单克隆抗体组合：CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP-cy5.5/CD4-PC-7/CD19-APC/CD8-APC-cy7。
1.2.2数据分析
待测样本混匀后检测并获取，使用Kaluza Analysis软件分析数据，传统人工分析应用Kaluza Analysis软件进行分析并结合抗原表达情况分析淋巴细胞各亚群百分比。AI分析应用AI模型分析，计算淋巴细胞各亚群百分比，并生成可视化结果。检测前校准流式细胞仪并调整电压、补偿等参数，淋巴细胞总数小于5 000个的FCS数据不纳入本研究。
1.2.3实验流程
AI辅助MFC检测LS免疫表型的流程图见图1。
图1 AI辅助MFC检测LS免疫表型流程
1.2.4AI模型建立
1.2.4.1无效细胞清除
(1)去除粘连体：根据非粘连体的线性分布特点建立线性回归模型:y=ax+b,得到线性分布主轴的位置参数a、b，以此参数为基准并参照人工分析特点去除粘连体。(2)去除死细胞和细胞碎片：根据细胞碎片前向散射(FSC)、侧向散射(SSC)极小，同时CD45阴性的特征去除细胞碎片。采用核密度估计模型计算FSC、SSC、CD45核密度概率密度函数。见公式1。
(公式1)
其中，f为核密度概率密度函数，fi1,fi2…fin为n个流式细胞的指定荧光标记的荧光强度值；
h为带宽，默认设为10；
K为核函数，采用高斯核函数(公式2)
(公式2)
得到细胞在FSC、SSC以及CD45上的密度分布曲线，并参照人工分析经验寻找极值来确定碎片在FSC、SSC以及CD45上的分布界限，从而去除细胞碎片。
1.2.4.2AI模型数据处理
采用高斯混合模型(GMM)为基础的聚类分析[10]对数据进行高斯分布拟合。见公式3。
(公式3)
带入特定变量x，求得在该分布下对应的概率N。其中μ代表总体均值，σ代表该分布的标准差，σ越大分群数越少；
反之，σ越小分群数越多。不符合高斯分布的数据采用改进的欧氏距离进行分析。见公式4。
(公式4)
其中d(x，y)代表目的细胞坐标位置(x，y)与固定点的距离。按最小距离原则将所有细胞点归入与其距离最小的细胞群内，从而将有效细胞分为若干个细胞群。
1.2.4.3抗体强度内对照模型
根据LS特征将粒细胞作为淋巴细胞特异性抗体的阴性内对照，通过粒细胞平均荧光强度确认淋巴细胞各亚群的阴性表达范围。
1.2.4.4淋巴细胞模型
根据淋巴细胞整体在SSC/CD45上的分布特征，以GMM聚类结果为基础，初步筛选淋巴细胞。参照粒细胞阴性内对照，综合人工分析的诊断标准，利用核密度分析方法对淋巴细胞荧光表达强度分布进行分析并分群[11]。
1.2.5AI分析数据
经标本制作获取FCS数据，将FCS数据输入AI模型并解析成与原始数据相匹配且AI模型可读数据。AI模型采用多维度聚类算法(pheno-graph、KNN、K-means等)将细胞分为多个集群，再利用自动分类器在多维空间中对细胞集群进行初步分类和定义。建立抗体强度内对照模型，参照粒细胞阴性内对照，综合人工分析的诊断标准，利用核密度分析方法对淋巴细胞荧光表达强度分布进行分析，确定淋巴细胞各亚群类型并输出各类细胞群百分比。
1.2.6AI分析重复性试验
用AI 模型对1 263份样本进行3次日间重复性分析，比较各细胞群的细胞数和荧光强度差值的变异系数(CV)。
1.2.7AI分析与人工分析检测速度比较
比较AI模型分析单个样本并生成的可视化结果的平均时间与传统人工分析方法的平均时间。
1.2.8AI模型性能评估
以人工分析结果为参照，对LS免疫表型FCS数据进行AI分析，AI模型分析与人工分析诊断结果按下述标准判定是否一致，并计算检测通过比例。判断标准：绝对误差允许±3%的允差、细胞占父类比例大于5%、相对误差小于15%为合格；
细胞占父类比例小于或等于5%、相对误差小于40%为合格。符合上述标准即判定为一致，否则判定为不一致。由高年资医师对结果不一致者进行人工复核，综合判断结果差异的原因。
1.2.9AI分析与人工分析一致性比较
计算1 263例样本两种分析方法各项淋巴细胞计数百分比平均差值，采用SPSS17统计软件通过配对t检验对LS细胞百分比进行统计学分析，并计算P值，以评价两种方法结果的一致性，以P<0.05为差异有统计学意义。计算两种方法质控平均值，以判定两种分析方法差异性的原因。运用MedCalc19.2.1统计软件对两种方法进行比对，通过Bland-Altman图分析95%置信区间(95%CI)。计算AI分析方法质控的重复系数(CR)评价该方法的可重复性。
2.1 AI分析结果的输出和可视化
AI分析可快速检测出外周血中LS的数量和百分比，可通过降维自动输出二维图，清晰展现多维空间细胞群分布及抗原表达水平。见图2。
a：NK细胞；
b：TCRγδ+T淋巴细胞；
c：辅助性T淋巴细胞；
d：细胞毒性T淋巴细胞；
e：B淋巴细胞。
2.2 AI分析重复性
细胞分群类别、各群细胞的细胞数、百分比及每群细胞表达抗原的平均荧光强度均相同，各项差值的CV均为0。
2.3 AI分析检测效率
AI分析单个样本平均时间为(1.36±0.25)s，而人工分析单个样本的平均时间约为60 s，分析疑难病例需7～8 min。AI分析较人工分析速度提高50倍以上。
2.4 AI模型性能
1 263例样本中1 199例结果与人工结果一致，检测通过比例为94.93%。64例样本的80个差异项与人工分析结果有差异。差异项病例数分别为:CD3+5例、CD3+CD4+9例、CD3+CD8+23例、CD3-CD19+11例、CD3-CD16+CD56+32例。
2.5 AI分析与人工分析结果的一致性
两种方法CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD4+/CD3+CD8比值、CD3-CD19+4项平均差值比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。经高年资医师复核，AI分析也会因异常T淋巴细胞的存在导致结果分析的差异。其余CD3+CD4+和CD3-CD16+/CD56+2项平均差值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，两项指标检测具有良好的一致性，可相互替代。见表1。人工分析质控的平均值为1.414，AI分析质控的平均值为0.384，提示AI分析比人工分析质量控制(QC)更趋向于0。AI分析方法质控的CR为2.833 1%，95%CI：2.726 8～2.948 1%，均小于临床可接受的临界值范围±5%，表明AI分析方法可重复性好。
表1 淋巴细胞各亚群细胞百分比比较
本研究初步建立了AI辅助MFC检测人外周血LS含量及百分比的诊断方法，基于多维空间聚类细胞群进行分析，可快速检测人外周血中LS百分比并降维后生成可视化结果。AI分析效率较人工分析提升约50倍以上，极大地减少了临床诊断工作量、压缩了检测周转时间，初步满足了临床诊断的需求，并可将多维分析结果以二维散点图形式输出，提高了可视化效果，并对异常群示警允许人工订正，避免了偶然因素引起的错、误诊。日间重复性试验结果显示，CV为0，AI分析不受人员疲劳程度、精神状态、人为失误等主观因素的影响。
研究发现，当总LS占比之和结果超过5%～10%时考虑样本中可能包含大量异常T淋巴细胞亚群,如TCRγδ+T淋巴细胞、双阴性CD4-CD8-或双阳性CD4+CD8+T淋巴细胞。如外周血样本中存在γδT淋巴细胞时为满足“(CD4++CD8+)%=(CD3+±5)%”的检测标准[12]，而AI分析会出现圈门不准确。在人工分析CD3/CD4细胞分群时由于单核细胞与淋巴细胞在二维散点图上界限不清，人工分析将部分单核细胞纳入淋巴细胞计数范围内,导致人工分析较AI分析数据百分比降低，而AI会多方位空间划分，将CD3-CD4+细胞群剔除整体淋巴细胞群。见图3。对大部分单一LS分析表现出较好的分析速度和准确率，但对个别复杂病例仍没有达到与人工分析完全相同的诊断效果，仍需高年资医师结合临床其他检测指标进行综合诊断，AI分析模型的建立是基于医师的分析方法而建立的，在机器学习算法方面虽然可通过数据进行训练，但仍受制于单一检测手段分析结果而缺乏思维灵活性，进而无法完全替代高年资医师检测结果。但该AI模型仍可作为一种临床决策支持系统和辅助诊断工具用于临床，可为低年资医师树立信心。
A：CD45圈出LS；
B：人工分析的CD3+CD4+二维散点图，人工分析圈出的淋巴细胞中可能含有部分单核细胞(粉色)；
C：AI分析的CD8+CD4+二维散点图。
AI借助强大的数据分析能力和计算能力用于医学各领域，尤其是多维图像解读及大数据分析[13-14]。研究者在疾病诊断领域挖掘AI辅助分析更快、更准、更便捷的方法，以满足临床疾病诊断的需要[15]。但AI辅助MFC分析方法的相关研究较少见，不同领域和疾病诊断类型对算法的要求不尽相同，且大多研究均基于小样本量的探索性研究[16-17]，在临床实际应用中尚存在不足[18]。有研究对比了7 784例淋巴细胞淋巴瘤患者和8 493例健康对照者的FCS数据，利用神经网络算法和10倍交叉验证建立了AI诊断模型，诊断准确率高达97%[19]。KO等[20]分析了1 742例 急性髓系白血病(AML)患者和5 333例 骨髓增生异常综合征(MDS)患者的FCS数据，通过对机器学习算法训练，使AML和MDS患者诊断率提高至84.9%～92.4%，诊断准确率达84.6%～89.7%，平均数据处理时间为7 s，极大地提高了检测效率。周丽娜等[17]以多维空间密度分布的非监督学习分群聚类算法为基础，应用决策树和随机森林等监督学习算法辨别细胞分类，并以二维图、降维t-分布领域嵌入算法和热图进行可视化呈现，提高了AI辅助诊断微小残留病的灵敏度和准确度。本研究基于聚类算法和核密度估计方法在AI辅助流式细胞术检测LS方面进行了初步探索及应用研究，AI模型使用的机器学习算法与其他算法比较，其优势：(1)计算伸缩性。该算法使用多个高斯分布的组合刻画数据分布，计算伸缩性好。(2)参数依赖性。可调整参数为数据分布的均值和标准差。(3)普适性能力。描述能力和泛化能力均优于其他算法。(4)抗噪声能力。优于K均值聚类算法。(5)结果解释性。模型和结果均具有解释性。该算法能更好地捕捉流式细胞数据的分布特点进行细胞聚类和分群。
尽管近年来AI技术在医学领域取得了一定的成功，AI机器学习方法在诊疗过程中的局限性和解决方案也被广泛地讨论[21-23]。但探索过程中仍面临AI辅助诊断不流畅、检验结果重复性不够、检测机构间水平差异等诸多问题，从而阻碍了AI模型的推广应用。同时AI算法导致的医疗责任归属及其“黑匣子”“可解释性”等诸多问题也使AI辅助诊断在临床应用中受限而破坏了其应用价值。因此，仍需在临床更多领域、更多算法进行验证，并建立基于AI模型的诊疗指南和行业标准，以确保检测流程标准化和结果的准确性和灵敏度。本研究通过1 263例患者淋巴细胞百分比数据进行分析建立了AI辅助诊断模型，未来希望能应用LS绝对计数的AI分析辅助临床提供更可靠、快速的结果，并有更多的机会对算法进行优化与训练，使诊断更精确，希望通过机器学习算法的优化和人工分析思路的高度融合不断提升AI模型识别复杂细胞群的能力。未来随着人类对AI的认知逐渐加深，AI模型识别流式细胞数据能力将会随着不断深入的研究和探索成为医师的左膀右臂，大幅提升诊断效率。
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