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陆胜民，陈巧云，黄振东，鹿连明，吴吉安，程序，王芳，孙华*
(1.浙江省农业科学院食品科学研究所 省部共建农产品质量危害因子与风险防控国家重点实验室，浙江 杭州 310021；
2.浙江省柑橘研究所，浙江 台州 318026；
3.台州市农业生态保护与质量安全中心，浙江 台州 318026；
4.台州市绿际农业开发有限公司，浙江 温岭 318000)
随着经济社会的不断发展和人们健康意识的增强，消费者对优质、无公害果蔬的需求不断增长，但种植户为提高作物产量，减少病虫害的影响，过度使用化肥、农药的现象仍普遍存在。由于长期施用化学肥料，残留在土壤中的化肥酸根将土壤中的钙、磷、钾等元素固定，生成不溶性物质，从而造成土壤板结、土层变薄和生物生存环境破坏，进而导致植物抗病虫能力减弱，也因过度施用农药造成果蔬等农产品中农残的超标。近年来研究发现，益生微生物菌剂(简称益生菌剂)作为一类含有活体微生物的新型制剂，可通过其代谢活动作用于土壤和作物，不仅能改善土壤结构，增加土壤肥力，提高肥料利用率，还能增加作物根际的有益微生物菌群，促进作物生长，降低作物病虫危害，提高农产品品质[1-2]。此类益生菌剂包括枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和溶杆菌属大多数细菌等[3-4]。张金秀等[5]发现，施用复合益生菌肥能促进青椒生长发育，降低病虫害，显著提高产量并改善品质，与常规肥相比增产13.84%。刘柳等[6]向菌糠与鸡粪混合发酵物中添加益生菌制成混合菌剂，喷施后可明显促进草莓生长，提高果实品质。益生菌剂有利于土壤中各种物质的分解和转化，在改善土壤性状和维护地力上具有独特作用[7]。发展和推广益生菌肥料，生产出高产优质的农产品，是绿色农业发展的必然趋势，同时也是实现农业可持续发展的必经之路。
红美人柑橘(爱媛28)是近年来浙江柑橘发展最迅速的优良品种，其化渣性好、糖酸比合适，深受消费者喜爱，但其生产管理要求较为精细，一般需要设施栽培，且对种植区的土壤、水肥等条件要求较高，在传统的施肥管理下，大部分红美人柑橘产区会产生不同程度的养分管理障碍，导致其果实品质参差不齐[8]。为考察益生菌剂施用对提高浙江省特色优势柑橘产量和果实品质的效果，本文对比研究了根施益生菌剂对红美人柑橘果园土壤理化性状、果树叶片、果实产量和品质的影响，以期为浙江省柑橘产业的提质增效提供有效的途径和应用技术基础，促进浙江省柑橘产业的高质量发展。
1.1 供试材料
试验基地位于浙江省温岭市的台州市绿际农业有限公司松门果园，面积超过18 hm2，土壤属盐碱地(pH 8.2)。试验用的红美人柑橘果树采用大棚设施栽培，树龄为7 a(2015年当年栽植1年生苗，667 m2栽密度为160株)。
益生菌剂由枯草芽孢杆菌和溶杆菌种经兼性厌氧培养发酵而成，培养基质为富含几丁质的虾贝类壳粉碎物及糖源组成。产品经汇智泰康生物技术(北京)有限公司检测，根据《微生物肥料生物安全通用技术准则》(NY 1109—2006)中急性毒性分级标准判定属实际无毒；
经农业农村部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心检测，产品发酵终点细菌总数>9.5×108mL-1，其中枯草芽孢杆菌数>9.0×108mL-1，霉菌杂菌数未检出，主要重金属未检出或远低于NY 1109—2006要求，pH 6.9。
以667 m2为施肥单位，益生菌施用组2015—2017年共施腐熟羊粪基肥5 t，2018年开始小范围试用益生菌剂1～2次；
2019—2021年对全园大范围采用土壤表面根施益生菌剂，其中第1年施2次(4月底和8月上旬)、第2年施3次(分别为4月底、8月上旬和10月上旬)、第3年施1次(4月底)，每次施30 kg发酵原液(加8倍水稀释)，配合年施复合肥60 kg。对照组为前3 a施腐熟羊粪基肥1.5～2 t，后4 a施复合肥80 kg。
1.2 样品采集
采样方法参照黄振东等[8]的方法。分别于2017年11月27日(施用益生菌剂前第2年)、2020年(施用益生菌剂第2年)随机收集果园的土壤、果树叶片和果实3份，土壤进行pH、有机质、水解性氮、有效磷、速效钾、交换性钙和镁、有效态铁、铜、锰、锌和硼含量分析，叶片进行全磷、全氮和钾、钙、镁、铁、铜、锰、锌、硼含量分析，果实进行理化指标与化学成分含量分析。2021年12月2日分别采摘益生菌施用组与对照组的果实进行果实理化指标、主要营养成分分析，并对产量及产值进行对比估算。
1.3 分析方法
1.3.1 土壤指标分析方法
pH值测定参照NY/T 1121.2—2006；
有机质测定参照NY/T 1121.6—2006；
水解性氮测定参照LY/T 1229—1999；
有效磷测定参照NY/T 1121.7—2014；
速效钾测定参照NY/T 889—2004；
交换性钙和镁测定参照NY/T 1121.13—2006；
有效态铁、铜、锰、锌测定参照NY/T 890—2004，有效硼测定参照NY/T 1121.8—2006。
1.3.2 叶片指标测定方法
全磷、全氮、钾、钙、镁、铁、铜、锰、锌、硼测定参照《土壤农业化学常规分析方法》。
1.3.3 果实指标测定方法
果实纵横径、皮厚以游标卡尺测定。品质指标以鲜样计，元素分析以干样计。单果重、果形指数、可食率、可溶性固形物(TSS)、总酸、固酸比和含水率测定参照GB/T 8210—2011；
维生素C(VC)测定参照GB/T 6195—1986；
全磷、全氮、钾、钙、镁、铁、铜、锰、锌、硼测定参照《土壤农业化学常规分析方法》。总糖按照苯酚-硫酸比色法、还原糖按照3，5-二硝基水杨酸比色法测定。
1.4 数据处理
重复3次。采用SPSS 21.0软件进行数据分析，若P<0.05则表示组间数据差异显著。
2.1 益生菌剂根施对红美人柑橘园土壤化学指标的影响
对比施用益生菌剂之前(2017年，对照组)和之后(2020年，施用组)的红美人柑橘果园的土壤化学指标的检测结果(表1)可以看出，益生菌剂施用2 a后有效促进了羊粪基肥的转化和土壤微量元素的释放，在果实产量增加的前提下，仍显著提升了土壤有机质、水解性氮、有效磷和速效钾的含量，有效提高了土壤中交换性镁和有效态铁、锌、硼含量，为红美人柑橘的树体长势维持及果实品质的提高提供了充足的有机质、大量和微量元素保障，但对交换性钙和有效态铜的影响不大，甚至还造成有效态锰含量较大的下降。土壤pH值由施用前的7.29提高至7.66。由于温岭市松门镇地处三门湾沿海，该地区的土壤pH值相对于内陆地区红黄壤和偏施化肥果园的酸性土壤普遍较高。由于树体和果实对碱性元素的吸收，种植红美人柑橘后的土壤pH值相比于种植前的(8.2)有所下降，但2020年果园土壤的pH值高于2017年(当年未覆膜)的，其原因可能是设施大棚内的土壤因较高的温湿度导致返盐的结果。红美人柑橘对种植区的气温、土壤、水肥等条件要求较高，在传统的施肥管理下易造成土壤的酸化和有机质含量的下降，但本试验中充足的有机质保证了红美人增产的同时也维持了土壤的微碱性，这与奚辉等[9]报道的滴灌施用有机液肥可提高土壤肥力、减轻土壤酸化、满足红美人柑橘生长需求的结果一致，也与范例[10]报道的利用益生菌溶液可有效提升土壤自我肥力，将土壤酸碱度恢复至中性的结果相符合。
表1 根施益生菌剂对柑橘园土壤化学指标的影响
2.2 益生菌剂根施对红美人柑橘叶片营养状况的影响
相比于处理前，土壤根施灌浇益生菌剂后红美人柑橘树叶片的全磷、全氮和钾等大量元素有不同程度的下降，铁、铜2种矿物元素含量大幅下降，但钙、镁、锰、锌和硼等元素含量却有不同程度的增加，尤其是锰、锌含量的增幅显著(表2)，这与施用益生菌剂后有效提高了土壤中交换性镁、有效态铁、锌和硼含量有关(表1)。土壤中含量升高的有效元素，被果树吸收利用后也提高了叶片中相应的含量。虽然灌浇益生菌剂后土壤中的有机质、水解性氮、有效磷和速效钾含量有较大的提高，但叶片中相应的大量元素却有不同程度的下降，尤其是磷和钾含量达到了显著水平。值得注意的是灌浇益生菌剂后土壤有效态锰的含量出现了显著的下降(表1)，而叶片中其含量却提高了2.54倍，这说明红美人柑橘叶片对锰的需求量较高，导致了土壤中有效态锰因输出而下降。韩文炎等[11]应用有效生物菌为2.6×107～2.9×107g-1的水溶肥(含50%以上的水溶性氮磷钾养分以及0.2%～3.0%的铜、铁、锰、硼、锌和钼等微量元素)于成龄茶园的龙井43，发现水溶肥能促进茶树叶片光合作用，提高新梢氮、钾、镁、硫和锌等营养元素的含量。本试验中除去果实增产带走营养元素影响外，施用益生菌剂后叶片的全氮、钾含量下降不明显，其镁、锌、硼含量都有较大幅度的上升，说明该益生菌剂也可能有助于红美人柑橘叶片的光合作用，相关的营养元素的变化趋势与韩文炎等[11]的报道相似。本试验中施用益生菌剂组叶片中的铁、铜含量的大幅下降及锰和锌含量的大幅上升(可能与代森锰锌用药有关)，其与红美人柑橘叶片光合作用的关系有待于进一步研究。
表2 根施益生菌剂对红美人柑橘叶片营养元素含量的影响
2.3 益生菌剂根施对红美人柑橘果实理化营养指标的影响
益生菌剂连续施用2 a后红美人柑橘果实的平均单果重高达293.7 g，比施用前的242.0 g显著高出21.4%(P<0.05)，表明益生菌剂可以大幅度提高果实的产量，但其可食率有所下降，则表明果皮有增厚增重现象，这可能是由于该施肥方式(重有机肥+益生菌剂)使土壤及叶片中氮、磷等大量元素比较充足，有利于果实膨大及果皮营养富集。尽管如此，处理组果实的可溶性固形物含量有所提高，而总酸含量下降，固酸比显著高于对照果，且VC含量也有所提高，表明施用益生菌剂后不仅能显著提高单果重，且品质更好。红美人柑橘以果实扁圆形或高扁圆形、果皮薄、果肉细嫩极易化渣而著称，跻身于高档名果之列，但其采后极易受挤压造成机械损伤而难以贮运，货架期相对较短[12]。本试验中益生菌剂处理的红美人果实单果重高、果型指数大、外形美观，虽可食率有所下降，但其内在品质高，且果皮增厚有利于减少果实贮运过程中的机械损伤，从而提高其商品性和延长其货架期(表3)。此外，果皮增厚也有利于今后对其进行综合利用，如萃取精油和色素、加工果皮蜜饯等，提高果实的附加值。
表3 施用益生菌剂对红美人柑橘果实理化营养指标的影响
2.4 益生菌剂根施对红美人柑橘果实理化品质指标、产量与经济效益的影响
为考察连续施用益生菌一段时间后对红美人柑橘果实品质、产量与经济效益的综合影响，我们对比分析了同一年处理组与未处理组红美人柑橘果实的相关指标和经济效益(表4)。结果表明，益生菌剂施用对红美人果实相关指标的影响趋势与2020年的分析结果类似，即施用组果实的纵横径、皮厚、单果重、果皮率均高于对照组，尤其是果实横径和单果重显著增加，同时果实的总糖和还原糖含量也显著高于对照组，说明益生菌剂处理可显著提高果实的糖度、大小和美观度(扁圆形)，从而显著改善了果实的商品性。处理组红美人柑橘的平均667 m2产量为2 100 kg，比对照高出500 kg，增产效果明显，在不考虑因内质提高而价格上涨因素前提下，按40元·kg-1计，则每667 m2可增收2万元，扣除667 m2益生菌剂的生产成本、喷施成本以及每667 m2年少施20 kg复合肥的节本，每667 m2综合经济效益可比对照组增加1万元以上。就内在品质而言，施用益生菌剂的红美人柑橘果实可溶性固形物含量虽略低于对照组的，但其总糖和还原糖含量显著高于对照组，说明12月2日采摘的红美人柑橘果实糖分以非还原糖为主，如淀粉、果胶等大分子多糖，其食用品质尚未达到最佳，但固酸比已达到20左右，风味更浓郁，且较耐贮藏。另外处理组的果实VC含量也高于对照组，说明其营养价值比对照组更高。
表4 益生菌剂施用对红美人柑橘果实理化营养指标及产量的影响
浙江省红美人柑橘栽培面积已达到0.6万hm2，投产面积超0.2万hm2，产值近15亿元；
全国种植红美人柑橘的省份超过18个，总栽培面积超3.33万hm2，投产面积超1万hm2，产值超50亿元，且投产面积仍在迅速增长，未来的供应量将大大提高[13]。各地上市的红美人柑橘因土壤、栽培管理技术差异等原因质量参差不齐问题将日益突出。由于商品性好、经济效益高，各地对红美人柑橘引种及栽培技术的研究报道仍较多[14-15]，但目前对红美人柑橘树体营养需求、影响果实品质和增产的关键因素如土壤地力条件和肥水管理等的研究报道相对较少，不利于红美人柑橘果实高商品价值和经济效益优势的持续凸显。
枯草芽孢杆菌为芽孢杆菌属的一种，已应用于水产养殖、环境治理和农业生产。其在农业生产上的作用机理[16]大致归纳为: ①菌体生长过程中产生的枯草菌素、多黏菌素、短杆菌肽等活性物质，对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显抑制作用；
②刺激植株产生抗病因子，提高植株免疫力；
③通过自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，与其他植株体内酶协同发挥作用，同时通过自身合成B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，促进植物生长发育。溶杆菌属具有独特的滑动性和溶菌活性，已报道溶杆菌属的大多数细菌对许多病原菌有显著的拮抗作用[4,17]。截至2012年底，溶杆菌属26种细菌中，只有少数几种细菌的胞外主要抑菌物质被分离得到，这些物质主要有胞外酶、小分子化合物及生物表面活性剂和抗生素3大类[4]。本研究首次应用由枯草芽孢杆菌和溶杆菌属细菌组成的益生菌剂根施灌浇于红美人柑橘果园，发现可显著提升土壤有机质、水解性氮、有效磷和速效钾的含量，有效提高交换性镁和有效态铁、铜、锌、硼含量，维持土壤的微碱性；
提高叶片钙、镁、锰、锌和硼等元素含量，尤其显著增加了锰、锌含量；
显著提高了单果重和固酸比，增产效应、商品性、内在品质和经济效益提高明显。本益生菌剂对红美人柑橘品质的影响与枯草芽孢杆菌和解磷细菌对苹果品质影响的报道[18]相近；
对土壤大量元素的影响与徐洪宇等[19]报道枯草芽孢杆菌有机肥可分别提高种植烟草土壤有机质、有效磷、速效钾和全钾含量的结果相符合。益生菌剂对土壤养分与果实品质的积极调控作用可能与枯草芽孢杆菌能显著提升土壤磷酸酶、脲酶、蛋白酶、蔗糖酶活性[18]有关，也可能与枯草芽孢杆菌和溶杆细菌对土壤微生态菌系的调节作用有关，其具体的作用机理有待于进一步研究。对益生菌剂施用前后土壤与叶片化学元素含量之间相关性、叶片营养状况与光合作用及其与果实品质之间关系变化影响的研究也将有助于揭示益生菌剂对红美人柑橘果树生长和果实品质积极调控的内在机制。
