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李毅翔,陈芋霏,王艳艳
(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)
酸枣为鼠李科枣属植物酸枣的果实。现代研究表明，酸枣的主要化学成分为黄酮、多糖、生物碱、氨基酸等[1]，其中，多糖具有明显的降血糖、降血脂、抗炎等作用[2-3]，也是有较强作用的抗氧化成分[4-5]。当前，酸枣多糖主要以蒸馏水作提取溶剂进行提取，文献报道的方法主要有热水浸提法、酶解法、微波提取法、超声提取法[6-8]等。然而，单一的提取方法常具有提取时间较长，耗费资源较多的情况。超声波提取法利用超声波对溶剂的空化作用和次级效应，促进植物多糖浸出，但其热效应不强，需要较长时间才能达到足够高的提取温度;微波提取法利用微波能量可迅速达到较高反应温度，使细胞内的活性成分更易释放，但传热传质不均匀[9]，将上述2种方法相结合时，具有高效率低能耗、生物活性好的优点。目前，已有将两者联合应用于植物天然成分提取的报道[10-11]，但尚未涉及酸枣多糖，且不同提取溶剂对成分的提取也有较大影响。因此，本研究通过超声-微波协同提取酸枣果肉多糖，优化提取工艺，并考察该成分的抗氧化活性，为充分利用酸枣资源提供科学依据。
1.1 材料与试剂
酸枣：采自山东省临沂市，去核。果肉于50℃恒温干燥箱中烘干，粉碎过50目筛，风干后密封，置4℃冰箱中保存，备用。
试剂(均为分析纯)：水杨酸、双氧水、钼酸铵、磷酸三钠，天津永晟精细化工有限公司；
硫酸亚铁、无水葡萄糖、维生素 C，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
DPPH，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。
1.2 仪器与设备
分析天平(MS105),梅特勒-托利多仪器有限公司；
数控超声波清洗器(KQ-500DB),昆山超声仪器有限公司；
常压微波合成工作站(MAS-II),上海新仪微波化学科技有限公司；
酶联免疫检测仪(Synergy MX),美国BIOTEK公司。
1.3 方法
1.3.1 不同提取方法对酸枣多糖提取率的影响 (1)超声辅助提取酸枣多糖:在酸枣果肉粉末中按一定料液比加提取溶剂，置于超声波提取器中，超声温度50℃、超声波功率设为400 W、超声25 min、提取液3 000 r/min离心10 min取上清液得酸枣多糖提取液。(2)微波辅助提取酸枣多糖:在酸枣果肉粉末中按一定料液比加提取溶剂，置于常压微波合成仪中，微波功率200 W、微波时间3 min,取出后冷却，3 000 r/min离心10 min取上清液。(3)超声-微波协同提取酸枣多糖:采用超声-微波协同提取的方式，考察二者协同顺序对实验的影响。微波-超声提取法具体工艺流程：去核酸枣粉末按料液比1 ∶30分别加入不同提取溶剂，200 W微波提取2 min再在50 ℃下400 W超声提取25 min,3 000 r/min离心10 min取上清液得酸枣多糖提取液；
超声-微波提取法则先进行超声，而后进行微波。
1.3.2 单因素试验 依据1.3.1 试验方法，考察不同提取溶剂、超声温度、料液比、超声时间对微波-超声联合协同提取酸枣多糖得率的影响。在试验过程中，各因素的考察范围：蒸馏水与pH值分别为4、5、6、7、8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液；
超声温度30、40、50、60、70 ℃；
超声功率300、350、400、450、500 W；
料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50(g/mL)；
超声时间5、10、15、20、25 min。考察协同提取顺序，先微波提取再超声辅助提取酸枣多糖得率较高，工艺优化以低能耗、高得率为目的，所以在研究其中单因素变量的影响时，其他各因素固定的条件为pH=7的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，超声温度50℃、料液比1 ∶30，先200 W微波2 min再400 W超声提取25 min。
1.3.3 响应面分析试验与酸枣多糖提取工艺的优化 在单因素试验基础上，确定超声-微波协同方式为先微波后超声，固定提取溶剂pH=7的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液,依据Box-benhnken 中心组合试验设计原理，以超声温度、料液比和超声时间3个因素为自变量，设计3因素3水平共计17个试验点的响应面分析试验(表1)。
表1 响应面分析因素的因素与水平
1.3.4 酸枣中多糖的测定 酸枣果肉中多糖含量的测定参照姜琼等[12]优化后的方法，并稍作修改。精密吸取酸枣多糖提取液60 μL置于微量离心管中，加入180 μL显色液(5%苯酚溶液与98%浓硫酸按体积比为1 ∶5混合)，充分涡旋，在沸水浴中加热25 min。冷却至室温，以加入与样品溶液同浓度乙醇为空白，在490 nm波长处测定吸光度，以葡萄糖为标准品，得到标准曲线y=3.575 6x + 0.169 9，结果显示，葡萄糖在0.049～0.295 mg/mL 与吸光度线性关系良好(R2=0.999 6)，其中x为葡萄糖质量浓度(mg/mL)、y为吸光度。根据标准曲线计算酸枣多糖质量浓度，并按式(1)计算多糖得率。
酸枣多糖得率(%)=[(n×C×V)/m]×100(1)
式(1)中，n为稀释倍数、C为待测样品的浓度、V为准确移取待测样品的体积、m为准确称取多糖样品质量。
从出土文献看，《居延新简》的《四时簿》《月言簿》中，明确记录了考核地方官员的标准，其中非常重要的一条就是：“务顺四时月令”。如EPF59·61号简：“制诏纳言：其令百辽，屡省所典，修厥职，务顺时气。”[14]《居延新简三》125-126EPF22·50号简：“部吏毋犯四时禁者，敢言之。”[14]《居延新简四》58EPF59·161号简：“会月二日，谨案部燧六所，吏七人，卒廿四人，毋犯四时禁者。谒报，敢言之。”[14]《居延新简三》138
1.3.5 酸枣多糖的抗氧化性分析 酸枣多糖提取物和维生素 C 的浓度梯度分别为质量浓度0.05、0.10、0.2、0.40、0.6、0.8、1.0 mg/mL。参照Yiling Zhu等[13]的方法进行酸枣多糖清除DPPH自由基和羟基自由基能力的测定。清除率计算公式如式(2)、(3)：
DPPH·清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]× 100
(2)
·OH 清除率(%)=[1-(A1-A3)/A0]× 100
(3)
式(2)、(3)中，A0为空白对照的吸光度、A1为自由基与多糖或阳性对照的吸光度、A2为样品的本底吸光度、A3为乙醇替代水杨酸乙醇溶液的样品本底吸光度。
2.1 不同提取方法对酸枣多糖提取率的影响
2.1.1 超声辅助提取酸枣多糖的得率 如图1所示，随着超声功率的改变，酸枣多糖得率逐渐上升，当超声功率达400 W时最高(28.64%)，继续加大超声功率，得率开始降低，可能是多糖分子在较强机械作用下断裂，引起提取率的急剧降低[14]；
而固定超声功率，考察超声时间发现处理时间为25 min时达到最高(28.59%)，继续延长超声时间，得率开始显著降低。延长超声辅助提取时间有利于植物与提取溶剂充分接触，但对性质不稳定的活性物质，在长时间高温条件下处理可能会导致提取率的下降。
图1 不同超声功率、超声时间对酸枣多糖得率的影响
2.1.2 微波辅助提取酸枣多糖的得率 如图2所示，多糖得率随着微波功率的增加，当微波功率为200 W时，得率达到最高(31.87%)，但当微波功率再增大时，因为提取体系温度更高，多糖断裂，且溶剂持续沸腾，水分快速蒸发，也使产率急速下降；
微波处理时间的延长也呈现先上升后下降的趋势，为微波时间为2 min时得率最大(32.06%)。
图2 不同微波功率、微波时间对酸枣多糖得率的影响
2.1.3 超声-微波协同提取多糖的得率 如图 3A 所示，pH=7的柠檬酸-柠檬酸缓冲溶液作溶剂时，多糖得率最大为41.37%，这是因为不同pH值下多糖中一些特定基团的溶解程度不同[15]，而柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，柠檬酸钠作为螯合剂，与果胶中的金属离子结合能力较强，增加了果胶的溶解性[16]，从而相较蒸馏水有更高的提取率；
如图 3B 所示，随着超声温度的提升先增高后降低，适当的温度能加速多糖的溶出，较高的温度则会使多糖结构破坏，当提取温度为60℃时多糖得率最大为41.27%；
如图3C所示，料液比为1：30时多糖得率最高为41.45%。由于微波能量较高，使溶剂在提取过程中逐渐耗失，溶剂和物料间的浓度差不断改变，当多糖溶出达到平衡时，增加溶剂体积可能降低了超声的工作效率，进而降低了多糖得率；
如图3D所示，微波-超声协同提取随着超声时间的延长，多糖得率呈先升高后降低的趋势。超声15 min时的多糖得率最高，为42.67%。与单一微波和超声辅助提取方法相比，协同提取缩短了提取时间，且二者联用所取得的多糖提取率明显高于超声提取和微波提取的最高值。
图3 不同提取条件对酸枣多糖得率的影响
2.1.4 不同提取方法提取多糖得率的比较 由图4可知，超声-微波协同提取中，协同顺序为微波-超声的辅助提取法获得的酸枣多糖提取率最高(39.84%)，超声-微波辅助提取率次之(37.99%)，单一微波辅助提取的提取率较低(32.06%)，单一超声辅助提取的提取率最低(28.64%)。微波-超声协同提取顺序的多糖提取率较高，可能因为二者协同作用，先通过微波高效快速穿透薄壁，短时间内达到较高温度，提高目标组分的扩散能力，再在超声环境下均匀提取，使细胞壁消融更彻底，短时间内细胞内的活性多糖充分溶出[17]。
图4 不同提取方法酸枣多糖提取率
2.2 响应面试验优化提取工艺
表2 Box-Behnken试验设计及结果
表3 响应面的方差分析结果
Y=+42.76-0.76A+2.25B+0.15C+0.92AB-0.99AC+0.72BC-1.99A2-1.83B2-3.79C2
(4)
2.2.2 最佳工艺条件及验证性试验 求解回归方程，得到酸枣果肉多糖提取的最佳工艺条件为超声温度 58.6℃、料液比为1 ∶39.15(g/mL)、协同提取超声时间为 15.9 min。预测酸枣多糖的得率 43.49%。为了方便实际试验操作，将理论条件进行近似处理，超声温度 60℃、料液比为1 ∶40(g/mL)、协同提取超声时间为 16 min。进行验证性试验，重复3次平行试验，得到的结果分别为 43.26%、41.75%、42.81%，其平均值为(42.61±0.78)%，与预测值差异不显著，说明该工艺具有稳定性和可行性。
2.3 酸枣多糖抗氧化性分析
2.3.1 酸枣多糖对DPPH·清除能力 DPPH·可以捕获或清除其他的自由基，而被广泛用于测定试样的抗氧化能力[19]。由图5可知，在质量浓度为0.05～1.00 mg/mL 氛围内，随着维生素C和酸枣多糖浓度的增加，对DPPH·的清除能力也明显增加。在酸枣果肉多糖质量浓度1 mg/mL时，对DPPH·的清除率达最大值19.12%，但清除率均小于维生素C，这表明酸枣果肉多糖对DPPH·具有一定的清除效果。
图5 多糖对DPPH·的清除作用
2.3.2 酸枣多糖对·OH清除能力 ·OH是活性氧中活性最强的一种自由基，可以氧化组织中蛋白质、糖、核酸等生物大分子，损伤细胞的结构与功能，导致机体坏死或突变，因此对羟基自由基清除的清除能力是抗氧化作用的一个重要指标[20]。由图6可知，对·OH 清除活性随酸枣多糖质量浓度的增加而逐渐增强，当浓度增大到 0.40 mg/mL 时，维生素C对·OH 清除率接近 100%。当酸枣多糖达1.0 mg/mL时，对·OH的清除率达32.99%，试验证明酸枣多糖也具有一定的清除·OH 能力。
图6 多糖对·OH的清除作用
以酸枣果肉多糖得率为评价指标，在单因素试验的基础上，通过响应面对酸枣多糖微波-超声提取工艺进行优化，得出多糖的最优提取率为(42.61±0.78)%，与模型的预测值较为接近。与单一超声辅助提取、单一微波辅助、超声-微波提取相比，提取率分别增加了13.97%、10.55%、4.62%，且工艺操作简单，节省提取时间，降低能耗污染，使多糖提取效益最大化。而一定pH值范围内的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液较蒸馏水也有较强的多糖提取能力。柠檬酸、柠檬酸钠作为常见的食品添加剂，可应用于食品加工生产中，提高产品风味的同时也能增加有效物质的溶出。体外抗氧化试验表明，酸枣果肉多糖具有较强的DPPH·和·OH 清除能力，其抗氧化活性随酸枣多糖浓度的增加而增强。酸枣果肉为中药酸枣仁的副产品，资源丰富，可作为良好的天然抗氧化剂来源，本研究将为酸枣的综合利用和相关功能性天然产品的开发与应用等提供科学依据。
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