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【摘要】 目的 观察氨基胍对2型糖尿病大鼠肾脏晚期糖基化终末产物(AGEs)和细胞凋亡的影响。方法 利用高糖高脂饮食及注射小剂量的链脲佐菌素(STZ)建立2型糖尿病大鼠模型,随机分为糖尿病组、氨基胍组,并设对照组,分别于16周观察大鼠肾脏形态结构、肾脏凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达和肾皮质AGEs含量。结果 电镜下见糖尿病组肾脏小管上皮细胞呈典型的凋亡改变,氨基胍组细胞凋亡明显减轻。免疫组化显示,糖尿病组肾小管上皮细胞中Bcl-2、Bax表达较对照组增多,氨基胍组Bcl-2蛋白表达较糖尿病组增多,Bax蛋白表达减少。氨基胍组大鼠肾皮质AGEs含量较糖尿病组明显减少。结论 氨基胍可通过降低糖尿病肾皮质AGEs含量调节凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达,抑制肾脏细胞凋亡。
【关键词】 糖尿病肾病;AGEs;细胞凋亡;氨基胍
The effects of aminoguanidine ontissue nonenzymatic glycation and kidney apoptosis in diabetic rats
MINGYi,LI Zhao-xin ,PANGLi-nan, et al.Department of endocrinology Weifang people"s hospital,Shandong 261041,China
【Abstract】 Objective To explore the effects of aminoguanidine on the advanced glycosylation end products and apoptosis in the kidney of diebetic rat.Methods The model was established by long term fat enriched and high energy diet ,lower dose of streptozotocintreated rats.Wistar rats were randomly divided into two groups:induced diabetic rats(DM group), aminoguanidine treated diabetic rats(AG group) ,established the control group rats(CON group) at the same time.Aminoguanidine was administered to diabetic rats for 16 weeks.Contents of AGEs in cortex of kidney were measured and analysed.Examined morphological changes of the kidney of diabetic rats treated with aminoguanidine.Investigated the signal protein expression relating apoptosis of Bcl-2 and Bax.Results Under transmission electronic microscope, typical morphological changes of apoptosis were observed among renal tubular epithelial cells in DM groups.Immuno-histochemistry showed: in DM groups,the expression of Bcl-2、Bax increased significantly.By AG group treatment, the number of apoptotic cell and the level of expression of Bax decreased,the expression of Bcl-2 in increased.Compared with CON group,contents of AGEs in cortex of kidney of DM group significantly increased.By AG group treatment contents of AGEs decreased.ConclusionAminoguanidine can reduce contents of AGEs in cortex of kidney of diabetic rat and regulate the apoptosis by promoting the expression of Bcl-2 and decreasing the expression of Bax.
【Key words】 Diabetic nephropathy;AGEs;apoptosis;aminoguanidine
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糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见和最严重的慢性并发症之一,也是糖尿病患者死亡的重要原因。目前对糖尿病肾病的确切发病机制尚不清楚。广泛为大家所重视的一个研究方向就是蛋白质非酶糖基化,这一过程可产生大量的AGEs[1]。研究表明,由持续高血糖所致的AGEs蓄积是引起DN的关键因素[2]。本研究应用氨基胍对2型糖尿病大鼠进行治疗,应用透射电镜、免疫组化技术观察药物对糖尿病大鼠肾脏的形态结构、凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax、肾脏皮质AGEs含量的影响,探讨氨基胍对糖尿病肾脏的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠30只,体重180～200 g,购于山东大学实验动物中心,合格证号SCXK(鲁)20030004。
1.2 主要试剂和仪器 One Touch血糖仪(美国Lifescan公司),H-7500型透射电子显微镜(日本日立公司),胶原酶Ⅳ(美国Gibco产品),蛋白酶K(美国Gibco产品),氨基胍(美国Sigma产品),羟脯氨酸标准品(美国Sigma产品),链脲佐菌素(美国Alexi公司),SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。
2 实验方法
2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立 大鼠适应性喂养1周,随机取10只为对照组,喂养正常饲料。其余20只全部给予高糖高脂饲料(炼猪油10%,蔗糖20%,胆固醇2.5%,胆酸盐1.0%,常规饲料66.5%)喂养4周,诱导出胰岛素抵抗。禁食不禁水24 h,给大鼠左下腹腔注射STZ30 mg/kg (溶解于0.1 mmol/LpH4.4枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液,稀释至0.5%浓度,新鲜配制)。正常对照组只注射相当体积的枸橼酸缓冲液。注射72 h后断尾取血测血糖,测血糖前,大鼠禁食8～12 h,血糖≥16.7 mmol/L确定模型建立并纳入本实验。血糖未达标的动物,1 d后追加STZ20 mg/kg,72 h后测定血糖全部达标。
2.2 动物分组与处理 造模成功的糖尿病大鼠随机分为糖尿病组10只,糖尿病+氨基胍治疗组10只。大鼠在造模成功后即开始给药,每日上午9～10时灌胃给药1次,氨基胍组用量每日100 mg/kg(1 ml/100 g),糖尿病组和对照组应用等容量蒸馏水(1 ml/100 g),灌胃共16周。实验期间各组动物自由进饮食。饲料全部由潍坊医学院动物饲养中心提供。灌胃期间每周断尾取血测定血糖一次,血糖 2.3 标本的留取 灌胃16周后,禁食12 h,断尾测空腹血糖。腹腔注射10%水合氯醛(按400 mg/kg体重)麻醉大鼠。迅速摘除双侧肾脏,取左肾少量皮质,切成约1 cm�3左右小块,放入3%戊二醛4℃固定,进行透射电镜观察。取左肾剩余皮质称重,置于-70℃冰箱保存,进行AGEs含量测定。取右肾组织放于4%中性甲醛中固定,进行免疫组化染色。
2.4 透射电镜样品制备[3] 将3%戊二醛固定的肾脏标本常规脱水、包埋、聚合、切片、电子染色,透射电镜下观察并拍照。
2.5 免疫组织化学染色 按常规ABC法进行免疫组化染色,显微镜观察阳性信号,以细胞浆和/或细胞膜染成黄棕色作为Bcl-2阳性信号,细胞浆染成黄棕色作为Bax阳性信号。
2.6 肾皮质AGEs测定 参照Tina Soulis-Liparota [4]的方法:将肾皮质剪碎制成匀浆,去脂,冲洗,Ⅳ型胶原酶、蛋白酶K消化处理,离心后的上清液即为被胶原酶消化的肾皮质胶原液;上清液用蒸馏水稀释一倍,避光静置1 h后用荧光分光光度计按370/440nm(激发波/发射波)测定荧光值,以含胶原酶的HEPES缓冲液荧光值为1个任意荧光单位(AUF),样品荧光强度依此折算;用氨胺T氧化法进行羟脯氨酸含量测定,将测得的羟脯氨酸值乘以因子7.14,即为胶原含量。最后肾皮质中AGEs含量以每毫克胶原中相对荧光强度(AUF/mg)表示。
2.7 统计学方法
所测数据结果以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 11.5统计软件包处理,对组间数据进行方差分析,P值0.01)(见表1)。
3.2 透射电子显微镜观察
电镜下可见CON大鼠肾小管上皮细胞细胞膜完整,细胞器丰富,线粒体良好无肿胀。糖尿病组大鼠肾组织细胞核内染色质趋边浓缩、聚集、细胞核周间隙增宽,细胞线粒体明显肿胀,细胞质吞饮泡大量增多,上皮细胞内可见凋亡小体。氨基胍组大鼠肾组织细胞核固缩、染色质趋边减轻,线粒体肿胀不明显。系膜区系膜基质增生,系膜细胞轻度增生。
3.3 免疫组织化学染色结果
3.3.1 Bcl-2蛋白的表达 Bcl-2蛋白主要位于肾小管,主要表达在细胞浆和细胞膜。对照组大鼠肾脏凋亡蛋白表达的很少糖尿病组凋亡细胞较对照组明显增多, 阳性细胞主要分布于肾小管上皮细胞及肾小球壁层细胞,肾小管蛋白表达明显增加,氨基胍组的蛋白表达较糖尿病组有所增多。
3.3.2 Bax蛋白的表达
Bax蛋白在肾小球、肾小管均有表达,主要表达在细胞胞浆内。对照组表达较弱,糖尿病组蛋白表达明显增多,而氨基胍组蛋白表达较糖尿病组有所减少。
3.4 肾皮质AGEs含量 肾皮质AGEs含量测定显示,糖尿病组大鼠肾皮质AGEs含量较对照组明显增加(P [2] 叶山东,朱禧星.氨基胍的作用机制及其在糖尿病慢性并发症中的应用.国外医学• 生理病理科学与临床分册, 1998, 18(2): 168-170.
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