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【摘要】 目的 比较胰酶和EDTA两种消化液消化感染水痘-带状疱疹病毒的2BS细胞冻融后的病毒滴度（VT）。方法 分别配制两种浓度的胰酶和EDTA：0.125%、0.25%的胰酶，0.01%、0.02%的EDTA各1000 ml，按比例加入预先培养好的携带水痘-带疱疹病毒的等量2BS细胞中，消化后，用显微镜观察细胞形态，消化液离心、浓缩、冻融、检测并比较病毒滴度。结果 与0.125%、0.25%的胰酶、0.01%EDTA， 0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合消化液相比，用0.02%的EDTA消化液消化感染水痘-带状疱疹病毒的2BS细胞，冻融后的病毒滴度提高了1.3～0.8个log值。结论 用0.2%EDTA消化液消化的含有水痘病毒的细胞获得的病毒滴度最好。
【关键词】 胰酶;EDTA; 2BS 细胞;病毒滴度
【Abstract】 Objective The analysis of the healing effect two digestive trypsin and EDTA digestion and chickenpox-herpes zoster virus 2BS cells after freezing and thawing of the virus titer（VT）. Methods The preparation of two concentrations of trypsin and EDTA: 0.125%, 0.25% trypsin, 0.01%, 0.02% EDTA all 1000 ml, added in proportion to carry a good pre-training varicella-zoster virus with the equivalent 2BS cells, digestion, cell morphology was observed with a microscope, centrifuge digestion, concentration, freeze-thaw, test and compare the virus titers.Results And 0.125%, 0.25% trypsin, 0.01% EDTA, 0.25% trypsin and 0.02% EDTA mixture of digestive juice, compared with 0.02% EDTA digestion digestive infection of varicella-zoster virus 2BS cells, the virus titer after freezing and thawing increased 1.3～0.8 a log value.Conclusion Digestion with 0.2% EDTA digestion of cells containing varicella virus titer obtained by the best.
【Key words】 Trypsin, EDTA; 2BS cells; Virus titers
水痘疫苗作为预防水痘-带状疱疹病毒的唯一有效制剂已问世多年，主要用2BS细胞培养病毒并制备疫苗，疫苗的制备工艺也以2BS细胞的转瓶培养代替其细胞的静止培养［1］，生产工艺中细胞消化是工艺必不可少的步骤，直接影响疫苗的质量，是生产工艺的关键点，以往没有文献报道，细胞消化一般采用胰酶和EDTA［2］，本研究主要以不同浓度的胰酶和EDTA消化细胞，冻融后通过细胞形态和病毒滴度检测，对疫苗的质量进行比较，该研究为生产高质量疫苗提供试验依据。两者虽然都是从培养皿上消化细胞，但取得的结果不同。作者主要是总结比较，通过不同消化液的消化方式，哪种方式获得的细胞利于冻融，不影响细胞内病毒存活，生产时获得高滴度疫苗。
1 材料与方法
1.1 材料及仪器设备 2BS细胞（人胚肺二倍体细胞由国家药品当局批准的二倍体细胞2BS）
1.2 胰酶（trypsin美国Becton,Dickinson and company）
1.3 EDTA（Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt国药集团化学试剂有限公司）
1.4 显微镜（型号XDS-1B厂家：重庆光学仪器厂）
1.5 转瓶机（型号GD/T76厂家：长城仪器设备厂）
1.6 细胞培养液：细胞培养液为含10%灭活小牛血清的Eagle"sMEM液，PH为7.2～7.3。
2 方法
2.1 配制0.125%、0.25%的胰酶细胞消化液 分别称取胰酶粉末1.25 g、2.5 g,先用少许灭菌过的PBS调成糊状，分别定容至1000 ml，室温搅拌至溶解，除菌过滤，分装，4℃保存备用。
2.2 配制0.01%、EDTA细胞消化液 秤取EDTA 0.1 g、Nacl 4.45 g,KCl 0.1 g,NaHPO4�12 h2O 1.45 g,KH2PO4 0.1 g,先用少许灭菌注射用水溶解，然后定容至1000 ml.
2.3 配制0.02%、EDTA细胞消化液 秤取EDTA 0.2 g、Nacl 8.9 g,KCl 0.2 g,NaHPO4�12 h2O 2.9 g,KH2PO4 0.2 g,先用少许灭菌注射用水溶解，然后定容至1000 ml.
2.4 制备2BS细胞 将长成单层的2BS细胞进行细胞计数，取等量的细胞传代接种于转瓶中，转瓶机置30 r/h，转瓶37℃培养成致密单层，该试验制备了25瓶细胞。
2.5 感染水痘-带状疱疹病毒 长成单层的2 BS细胞按一定比例加入水痘-带状疱疹病毒毒种感染细胞,35℃～36℃培养至细胞病变达75%以上。
2.6 消化感染病毒细胞 将病变细胞用生理盐水冲洗细胞面,洗去牛血清,分别用不同浓度的等量的胰酶及EDTA液消化感染细胞。
2.7 镜检及病毒滴度检测 抽取不同消化液消化后的感染细胞计数并显微镜下观察细胞形态，取不同消化液消化的感染细胞用用蚀斑法［3］（PFU）在2 BS株进行病毒滴度测定。
3 结果
不同浓度胰酶消化感染细胞时，显微镜下观察，细胞明显收缩，吸管吹打后细胞多呈单个圆缩形。不同浓度EDTA消化细胞时，显微镜下观察，细胞收缩不明显，吸管吹打后细胞成团，不分散成为单个细胞。与0.125%、0.25%的胰酶、0.01%EDTA、0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合消化液相比，用0.02%的EDTA消化液消化感染水痘-带状疱疹病毒的2BS细胞，冻融后的病毒滴度提高了1.3～0.8个log值，结果见表1。
表1 不同种细胞消化液获得的疫苗滴度比较
4 讨论
多年的实践证明，疫苗的有效性与病毒滴度成正，获得高滴度病毒对疫苗的质量至关重要，该研究显示用较低浓度的EDTA消化感染病毒细胞可以提高疫苗的质量，分析其原因可能与胰酶及EDTA的特性有关［4，5］。胰酶是一种蛋白酶，在特定的位置降解蛋白的，它可以将细胞膜上的与培养瓶结合的蛋白降解，从而使细胞和培养皿脱离。EDTA是一种螯合剂，因为细胞表面很多和培养瓶结合的蛋白都是带有Ca2+或者Mg2+的蛋白，而 EDTA就是螯合Ca2+或者Mg2+的，从而加速细胞和培养瓶的脱离。所以胰酶这种蛋白的降解作用致使在冻融后对病毒也有作用，其作用机理有待进一步研究。显微镜下可以观察到EDTA与胰酶的消化细胞的形态截然不同，前者不使细胞分散，后者可以分散成单个细胞，而且高浓度胰酶消化的病毒滴度低于较低浓度胰酶消化的病毒滴度，这也进一步说明胰酶消化后对病毒的影响。EDTA消化后所获得的病毒滴度明显高于胰酶的消化后所获得的病毒滴度，即使与胰酶联合使用时，说明EDTA消化对病毒的影响比胰酶消化小,EDTA消化的浓度与病毒滴度呈正相关，本研究的试验数据对于水痘疫苗生产具有指导意义。
参 考 文 献
［1］ 刘晔,李生军,李春明,等.冻干水痘减毒活疫苗转瓶生产工艺的建立.中国微生物免疫学进展，2004,32（1）:9-12.
［2］ 鄂征.组织培养和分子细胞学技术.北京出版社，1995:76-79.
［3］ 中国药典三部,2010.
［4］ R. Ian Freshney. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th Edition,2005.
