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中图分类号：R743.34 文献标识码：A 文章编号：1672-3783(2008)-2-0007-03 【摘 要】 目的 探讨头穴针刺对脑出血大鼠兴奋性氨基酸含量的影响。 方法 选取健康雄性Wistar大鼠160只，随机分为脑出血组，脑出血+针刺组(简称针刺组)，脑出血+脑复康组(简称脑复康组)，每组又分为术后6h、1d、2d、3d、7d三个时相点，每个时相点10只大鼠，另设空白对照组10只大鼠，制备脑出血大鼠模型，在光镜、电镜下观察各组大鼠脑组织形态学改变。运用免疫组化的检测方法，观察不同时相点头穴针刺治疗对GLU的表达。 结果 针刺组大鼠GLU含量随不同时相点的变化而逐渐减少，至7d时达最低与脑出血组比较有显著性差异(p 1.2 实验方法
1.2.1 脑出血模型的制备 参照邹氏法[1]和Rosenberg[2]方法进行改良，用10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上，取头皮正中，备皮消毒，正中切口，骨膜剥离器剥离骨膜，暴露前囟及冠状缝，取Bregma点右旁开3.5mm，后0.2mm定点，用牙科钻钻直径为1.0mm的圆孔，深达硬脑膜表面，鼠尾酒精消毒，距尾端3cm处剪断鼠尾，用微量注射器取血50ul，将微量注射器固定于立体定位仪上，沿钻孔进针约6mm，将未肝素化的静脉血50ul以20ul/min速度推进尾壳核，留针约5min，缓慢出针。留针期间酒精棉球包扎鼠尾断端伤口，术后局部喷洒庆大霉素，用牙科水泥封闭颅骨伤口，缝合头皮，局部皮肤采用碘酚消毒，防止局部感染影响指标观察。
1.2.2 动物分组 按体重将160只大鼠随机分为脑出血组，脑出血+针刺组，脑出血+脑复康组三组，每组又分为术后6h、1d、2d、3d、7d五个时相点，每个时相点10只大鼠，同时设10只正常大鼠为空白对照组。针刺组大鼠在脑出血模型制备成功后于不同时间点给予针刺治疗，6h、1d各给予针刺1次，2d、3d、7d组针刺每日1次，分别连续针刺2d、3d、7d。针刺患侧百会穴透曲鬓穴，取穴方法参照华兴邦等[3]制定的《实验动物穴位图谱》留针30分钟，期间捻转3次，每次5分钟，以200转/分速度捻针。脑复康组给予脑复康稀释液灌胃(按人：大鼠体重为200：1配置)6h、1d各给予1ml/次、3次/d，灌胃1天。2d、3d、7d组分别连续灌胃2d、3d、7d，1ml/次、3次/d。空白对照组为正常大鼠，在光镜及电镜下观察大鼠正常脑组织结构，与其它三组做对照。
1.2.3 标本取材 术后在相应时相点过量麻醉，迅速开胸暴露心脏，从左心室插管至主动脉根部，在右心耳剪开一小口做出口。4℃生理盐水200ml快速灌注，之后稍减慢灌注速度冲洗至流出液清亮，换4%多聚甲醛200ml快速灌注，之后稍减慢灌注速度继续固定灌注约30分钟至动物四肢变硬。断头取脑，以注射针道为中心做冠状切片，厚度约5mm。部分标本按常规程序制成厚度5um的石蜡切片用于HE染色及NGF原位杂交检测，部分标本切成1×1×1mm�3大小，放入 2.5%戊二 醛固定液中制成电镜标本。
1.2.4 HE染色 石蜡切片，常规脱蜡水化，苏木精5分钟，水洗，盐酸酒精分化20秒，充分水洗，弱氨水返兰20秒，充分水洗并浸泡10分钟，伊红染色20分钟，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.2.5 GLU免疫组织化学检测 ①切片常规脱蜡至水。②置于3 %H202溶液中孵育5～10分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗5min×3次。③热抗原修复：将切片浸入0.01mol/L、PH6.0枸椽酸盐缓冲液中，加热至92～98℃30分钟(进行抗原修复)，室温冷却30分钟，PBS洗5分钟。④滴加正常山羊血清封闭液37℃孵育30分钟。⑤滴加一抗(1：50稀释，兔抗大鼠NSE多克隆抗体)，4℃孵育过夜；PBS洗5分钟×3次。⑥滴加入生物素化二抗工作液(山羊抗兔IgG) 37℃孵育30分钟；PBS洗5分钟×3次。⑦DAB显色：使用DAB显色试剂盒(ZLI-9032)，取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，均匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间，一般在5～10分钟之间蒸馏水洗涤。⑧苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。
1.2.6 图像分析 光学显微镜下，DAB显色阳性细胞呈棕黄色或褐色，利用Motic Med6.0病理图像分析系统，在400倍视野下，每张片随机观察并计数脑出血区血肿周边5个不重复视野的阳性细胞数目，取其均值，进行组间比较。
1.3 统计学处理 采用SPSS 11.0软件进行统计。计量数据以x ±s 表示。各时相点比较采用单因素方差分析，各实验组间的两两比较采用q检验，以P[4]NM DA受体直接与阳离子通道相藕联。兴奋性氨基酸通过作用于NM DA受体，可分别使细胞膜Na+、K+等通道开放，引起神经细胞N a+、Ca2+内流、K+外流造成细胞内N a+ .Ca2+浓度明显升高与K+浓度降低，从而对神经产生毒性作用，并引起脑水肿。脑出血血肿形成后，周围脑组织由于缺血缺氧导致血脑屏障破坏，使兴奋性氨基酸自神经组织中大量漏出或释放至细胞外液，随着损伤时间的延长，能量代谢逐渐改善，血脑屏障中毛细血管内皮细胞的完整性逐渐恢复。通过对实验结果的分析，我们认为脑出血后早期兴奋性氨基酸的显著性升高是引起脑水肿和继发性神经元损害的重要原因之一。
本实验通过头穴针刺治疗脑出血大鼠，观察不同时间GLU的变化规律。结果显示随着脑出血术后时间的延长，针刺组大鼠GLU的表达逐渐减少，与脑出血组比较有显著性差异(P
