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[摘要] 目的 探讨白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1Ra）对已开始退变椎间盘细胞基质代谢的影响。方法 36只大鼠采用去双上肢及折尾法建立大鼠退变椎间盘模型，随机分为实验组和对照组，每组18只。实验组从造模3个月后给予腹腔注射IL-1Ra（50ng•kg-1），隔日1次，对照组不给予任何处理。造模后4、5、6个月每组分别处死6只大鼠，完整取出L4-5椎间盘后进行固定、切片，HE染色观察椎间盘形态学变化，免疫组化染色法测定Ⅱ型胶原的含量；取出L5-6椎间盘，使用间苯三酚法测量蛋白多糖含量。结果 实验组大鼠椎间盘Ⅱ型胶原灰度值低于对照组，蛋白多糖含量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 IL-1Ra可以延缓已退变的大鼠椎间盘继续退变，本研究为IL-1Ra应用于临床治疗椎间盘退变提供了理论依据。�
[关键词] 椎间盘；退变；免疫组化；白细胞介素-1受体拮抗剂�
[中图分类号] R681.53 [文献标识码] A [文章编号] 1671-7562（2008）02-0093-04��
The effects of the interleukin-1 receptor antagonist protein on the �
degenerative intervertebral disc of the bipedal rat ��
FAN Meng-po，WANG Chen,WU Xiao-tao，MAO Zu-bin，WANG Jun,LI Jian,LIAO Jia-xin
(Department of Orthopaedics,Zhongda Hospital,Southeast University,Nanjing 210009,China)��
Abstract:Objective To explore the effects of the interleukin-1 receptor antagonist protein（IL-1Ra）on the degenerative intervertebral disc of the bipedal rat. Methods Degenerative model of bipedal rat was stablished. Thirty-six rats were randomly divided into experimental group and control group，each group had 18 rats. The rats in experimental group were intraperitoneally injected with IL-1Ra（50ng•kg-1）after three months of operation and repeated on alternative days until they were killed，while the rats in control group accepted no treatment. Six rats were killed from every group at four,five,six months post-operation respectively. The tissue of L4/5，L5/6 discs were fixed and sliced.HE Staining was used to investigat the change of morphologic.TypeⅡcollagen was detected by immunohistochemistry staining，and the content of proteoglycan was measured by phloroglucin. Results The gray scales of typeⅡcollagen in experimental group was lower than those in control group(P[1]，目前发现IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra）是体内产生的唯一能阻断IL-1所有生物学效应的物质。李强等[2]预防性应用IL-1Ra于双后肢大鼠椎间盘退变模型，发现IL-1Ra有延缓大鼠椎间盘退变过程的作用。本实验通过对椎间盘已退变的大鼠腹腔注射IL-1Ra研究IL-1Ra对退变大鼠椎间盘的作用，为IL-1Ra临床应用提供理论依据。�
1 材料与方法�
1.1 实验动物和试剂 �
出生48~72h的清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠共12窝计106只，雌雄不限，由东南大学医学院实验动物中心提供。重组IL-1Ra购自南京布克生物技术有限公司，兔抗大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒均购自武汉博士德公司，间苯三酚购自国药集团化学试剂有限公司，磨砂防脱玻片购自北京中杉生物工程有限公司，日本OLYMPUS光学显微镜。�
1.2 实验动物模型的建立、分组与处理�
双后肢大鼠模型的建立参考Cassidy等[3]方法，将新生SD大鼠低温麻醉10min，无菌条件下自大鼠双前肢肱骨上端及鼠尾基部用丝线结扎并切除双前肢和尾部，严格止血，放置于37℃烤箱约10min。待其苏醒后放回母鼠笼中母乳喂养，待断乳后随机选择36只，随机分为对照组和实验组，每组18只。雌雄分开喂养，逐渐增加食物和水的高度迫使大鼠必须依靠双后肢站立，并培养其直立行走的习惯。造模3个月后，大鼠椎间盘已有一定程度的退变[4]。实验组给予隔日腹腔注射重组IL-1Ra 150ng•kg-1，对照组注射等量生理盐水。分别于造模后的第4、5、6个月（即给药后满1、2、3月）时各处死6只大鼠，取出腰椎，剔除椎间盘周围的肌肉及脂肪组织，沿L4、L5椎体的上下终板完整取下L4-5椎间盘组织，立即用蒸馏水冲洗3遍后置10％中性福尔马林缓冲液中固定24h，常规EDTA脱钙、石蜡包埋，沿椎间盘正中向两侧按5μm矢状面连续切片共8张，5张作Ⅱ型胶原免疫组化，3张作HE染色。按上述方法取出L5-6椎间盘置于深低温冰箱中集中留作检测蛋白多糖。实验过程中各批标本分别集中取材，标本的处理及检测等各实验步骤均保持严格一致。�
1．3检测方法�
1.3.1 免疫组化法测胶原含量
石蜡切片常规脱蜡至水，30%H2O21ml加入蒸馏水10ml，将混合液滴于组织块上，置于室温下10min，蒸馏水冲洗3次，复合修复液修复10min，蒸馏水洗3 次，滴加5%BSA室温封闭20min，甩去多余液体，不洗，滴加浓度为1∶50 兔抗大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体4℃过夜，PBS冲洗后滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃放置20min，滴加SABC置于37℃20min，DAB显色，肉眼观察组织显色为咖啡色时用蒸馏水冲洗，苏木素复染30s后常规脱水、透明、封片。每组随机抽1张作阴性对照，即将一抗换为PBS，余步骤同前。所有免疫组化切片均在同一条件下由熟悉相关知识的非本课题组技术人员使用Simple PCI 图像分析软件对髓核中Ⅱ型胶原的含量进行分析。将灰度值阈值调为0~255，灰度值越高表明胶原的含量越低。灰度值为胶原的相对含量。�
1.3.2 蛋白多糖测定 将深低温冰箱中保存的椎间盘组织取出置入离心管中，加入3%NaOH0.5ml置于恒温振荡器中振荡3h，温度控制在40℃。加入HCl 约2ml调整溶液pH值至8～9，加入100mg•ml-1胰蛋白酶50μl酶解2h，间苯三酚法[5]测定溶液蛋白多糖含量，结果以mg•（100mg）-1表示。�
1.3.3 HE染色 标本脱蜡至水，苏木素染色液染色10min，蒸馏水冲洗去多余的染色液，约10min后蒸馏水再洗涤一遍，放入95%乙醇5s。滴加伊红染色液染色2min，脱水、透明后封固，留作镜下观察。�
1.4 统计学处理�
数据以�x-±s表示，将数据输入SPSS 11.5统计软件包进行统计学处理。组间比较采用t检验，P[3]用双后肢普通大鼠建立椎间盘退变动物模型，在实验中发现,正常老年大鼠髓核中脊索细胞随年龄的增长而逐渐发生退变,双后肢大鼠的退变更严重,髓核细胞的这种退变与人类椎间盘细胞的退变规律完全一致。�
蛋白多糖是椎间盘细胞外基质的主要成分,它是一种由多肽为主链,以许多氨基多糖为侧链组成的大分子体。蛋白多糖单体(亚单位)由包埋于中央的核心蛋白和它两侧的糖胺聚糖链组成。糖胺聚糖链占蛋白多糖分子质量的90%以上,是蛋白多糖的主要功能基团,主要由透明质酸(hyaluronan,HA)、硫酸软骨素(chondroitinsulphate,CS)和硫酸角质素(keratansulphate,KS)组成,其中HA含量极低,而以CS和KS为主,由于蛋白多糖分子中CS和KS的每个双糖单位分别带有硫酸基和（或）羧基的负电荷,因此蛋白多糖不但使椎间盘总离子数大于血浆而形成盘内高渗透压,更能控制带电溶质在组织内的分布和转运。盘内高渗透压能够吸附大量的水分子,是椎间盘保持黏弹性、抵抗外来压力、吸收震荡等生物力学特征的生理基础,是维持椎间盘生物力学功能的基础[6]。可见蛋白多糖的丢失将会引起并加速椎间盘的退变。�
IL-1基因家族定位于人类染色体 2q13-14上,全长约 430kb，人体内的IL-1有IL-1α和IL-1β两种受体可与IL-1Ra结合。椎间盘中, IL-1β具有刺激体外培养的髓核、纤维环细胞产生 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9等金属基质蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）,从而减少蛋白多糖的产生,降低Ⅰ、Ⅱ型胶原和SOX6基因的表达等功能[7]。MMPs是椎间盘基质的主要降解酶，过量的MMPs可破坏椎间盘细胞外基质，抑制细胞合成蛋白多糖，从而使髓核中蛋白多糖减少、胶原强度降低，逐渐使椎间盘退变。SOX6基因是与椎间盘退变密切相关的因子，它能增加椎间盘基质中Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成，理论上可延缓椎间盘退变的发展［8］。IL-1还可刺激椎间盘基质细胞产生肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、NO等。TNF-α促进MMPs的产生和分泌,引起软骨基质的降解,并可抑制软骨细胞合成具有透明软骨特性的蛋白多糖和Ⅱ型胶原,促进生成有纤维母细胞特性的I型胶原,从而使软骨细胞变性死亡，加快椎间盘的退变。NO通过和氧竞争与细胞色素氧化酶作用而抑制线粒体的呼吸，导致细胞内ATP水平的下降，从而引起椎间盘细胞凋亡，NO也参与IL-1 对椎间盘蛋白多糖及胶原合成的抑制作用。此外，IL-1是一种重要的炎症介质，可以协同IL-6等介导的无菌性炎症加速椎间盘的退变。可见阻断IL-1的生物学效应可延缓椎间盘的退变，目前发现IL-1Ra是体内产生唯一能阻断IL-1所有生物学效应的物质。�
本实验结果显示，第4、5、6个月时实验组及对照组髓核中Ⅱ型胶原灰度值及蛋白多糖的含量的差异有统计学意义（P[9]将IL-1Ra的基因导入腺病毒，再将转染的腺病毒注射到退变的椎间盘细胞中，通过检测发现IL-1Ra蛋白含量增加并能持续两周。国外已有将IL-1Ra应用于动物及人体治疗类风湿性关节炎和骨关节炎的报道，但将其应用于椎间盘退变的治疗尚未见报道。李强等[2]于造模后未等大鼠椎间盘退变即给予预防性用药，尚不能说明IL-1Ra能够治疗已退变的椎间盘。本实验造模后3个月，大鼠已站立行走2个多月，其椎间盘已退变，然后进行给药，结果证明IL-1Ra能够治疗已退变的椎间盘。但要将IL-1Ra应用于临床治疗椎间盘退变，其给药方式及剂量尚需进一步研究。�
[参考文献]�
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[3]Cassidy J D,Yong-Hing K,Kirkaldy-Willis W H,et al.A study of the effects of bipedism and upright posture on the lumbosacral spine and paravertebral muscles of the Wistar rat[J].Spine,1988,13(3):301-308.�
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[收稿日期]2007-10-24
