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【摘要】 目的 从广西圆斑蝰蛇毒中分离纯化凝血因子X激活剂(factor X activator of Russell’s viper venom,RVV-X)并研究其止血作用。方法 应用阴离子交换色谱和凝胶过滤从广西圆斑蝰蛇毒中分离纯化RVV-X,以复钙化时间进行活性鉴定,以SDS-PAGE测定纯度和分子量。观察RVV-X对家兔肝脏创伤出血模型出血时间及出血量,家兔和肝素化小鼠凝血时间的影响。结果 广西圆斑蝰粗毒经阴离子交换色谱获得六个蛋白峰,将RVV-X所在第V峰用凝胶过滤获得的组分A为RVV-X纯品,其凝血活性具有钙依赖性。SDS-PAGE非还原性条件下呈单一蛋白条带,分子量约为97.8kDa,还原性条件下呈二蛋白条带,为一条重链(约76.3kDa)和一条轻链(约21.5kDa)。RVV-X可显著减少家兔肝脏切口的失血量,缩短切口出血时间;能显著缩短家兔及肝素化小鼠凝血时间。结论 用层析方法从广西圆斑蝰蛇毒中分离得到的凝血因子X激活剂具有较强的止血活性。
【关键词】 凝血因子X激活剂;离子交换;凝胶过滤;止血作用;圆斑蝰
Purification and Haemostatic Effect of Factor X activator from venom of Vipera russellii in Guangxi
XIE Yun,XU Yun-Lu.
Laboratory of Snake Venom Research,Fujian Medical University,Fuzhou350004,China
【Abstract】 Objective To isolate and purify the coagulation factor X activator from venom of Vipera russellii in Guangxi and to investigate its hemostasis effects.Methods RVV-X was purified from Russell’s viper venom by ion-exchange chromatography and by gel filtration. Homogenicity and molecular weight of it were determined in SDS-PAGE.Then we observed effects of intravenous RVV-X on model of hepatic trauma rabbit , on blood coagulation time in rabbit and heparinized mice. Results RVV-X was isolated from the venom of Vipera russellii.It could shorten the coagulation time in the presence of Ca.2+ ions.It consisted of a single polypeptide chain, with a mol. wt of 97,800 in nonreducing conditions and composed of one heavy chain (76,300Da) and one light chain(21,500Da) in reducing conditions.RVV-X could obviously decrease blood loss of rabbits liver wound and shorten bleeding time.It could also shorten the coagulation time of rabbit and heparinized mice. Conclusion RVV-X extracted from the venom of Vipera Russellii in Guangxi possesses considerable hemostatic activities.
【Key words】 Factor X activator;Ion-exchange chromatography;Gel filtration;Hemostasis effect;Vipera russellii
作者单位:350004福建医科大学药学院蛇毒研究所
蛇毒中含有多种可以影响哺乳动物凝血系统的酶类,其中在蝰亚科、蝮亚科、眼镜蛇科等蛇毒中存在着一类能激活凝血因子X的促凝组分-FX激活剂。国外对FX激活剂的研究主要集中在分离纯化、分子结构、凝血机制等方面[1~4],国内也报道了其在实验鼠体内的具有促凝血作用[5],但至今尚无FX激活剂作为止血药被开发上市。圆斑蝰蛇毒是已知作用最强的促凝蛇毒,FX激活剂含量丰富,且圆斑蝰在我国分布广泛,是常见毒蛇之一,取材较容易。本文应用层析方法从广西圆斑蝰蛇毒中分离纯化RVV-X并对其止血作用进行研究,旨在为进一步开发提供实验资料。
1 实验材料
1.1 试剂 广西产圆斑蝰蛇毒由福建医科大学蛇毒研究所提供;低分子量标准蛋白(上海生物化学研究所);立止血(瑞士素高药厂,批号574605);肝素钠注射液(万邦医药有限责任公司,批号0809119);华法林钠片(上海信谊九福药业有限公司,批号090303);其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器 HiPrep 16/10 DEAE FF预装柱、Superdex G-75凝胶柱、A¨KTA Explorer和Hofer电泳仪均为Pharmacia公司产品;Allegra离心机,Beckman公司产品;BSZ-100自动部分收集器、恒温水浴箱等均为国产仪器。
1.3 实验动物 昆明种小鼠,体重(20±2)g,雌雄兼用(闽实动质准第004-07);健康家兔,体重(2.2±0.2)kg,雌雄兼用(闽实动质准第005-20),福建医科大学实验动物中心提供。
2 方法
2.1 RVV-X的分离纯化和鉴定 广西圆斑蝰蛇毒粗毒0.2 g溶于4 ml 0.05 mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.4),4℃10000 rpm离心15 min,取上清液上HiPrep 16/10 DEAE FF阴离子交换柱用相同缓冲液及0.2～0.5 mol/L NaCl阶段性梯度洗脱,流速为3 ml/min,部分收集器自动收集洗脱液,每管3 ml。以复钙化时间测定各洗脱峰,收集凝血活性具有钙依赖性的V峰真空低温浓缩为约5ml过SuperdexG-75凝胶柱(16×55 cm)进一步分离,用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)洗脱,流速为1 ml/min,部分收集器自动收集洗脱液,每管2 ml,根据A280 nm值绘出洗脱曲线。
2.2 RVV-X的纯度鉴定和分子量测定 采用SDS-PAGE(Tris-甘氨酸系统)碱性不连续电泳。浓缩胶,T=4%,C=2.6%;分离胶,T=10%,C=2.6%;电极缓冲液为含0.1%SDS的Tris-甘氨酸缓冲液。样品按是否含有2%β-巯基乙醇分为还原性和非还原性。
2.3 RVV-X的止血作用 本文所定义RVV-X活性单位是参考立止血的酶活性单位而定,1u是指1ml RVV-X溶液在37℃条件下与1ml含枸橼酸钠的标准人体血浆混合后加入1 ml 0.025 mol/L的氯化钙溶液能在(60±20)s内发生凝结。
2.3.1 RVV-X对家兔肝创伤出血模型出血时间及出血量的影响[6]
家兔24只,随机分为4组,每组6只,分别为RVV-X 0.02 u/kg、0.005 u/kg及0.00125 u/kg三个剂量组和立止血组(0.05 KU/kg)。家兔麻醉后仰位固定,分离出肝脏,在肝脏右叶中部做一切口(长1 cm,深0.5 cm)。将滤纸(8 cm×8 cm)称重后平铺于出血创面上用砝码加压(20 g),每15 s观察一次,直至停止出血,记录出血时间,并通过滤纸前后重量之差计算出血量。经兔耳缘静脉注入药物,15 min后在原切口旁约5 mm处做一相同切口,以同样方法测定用药后的出血时间和出血量。
2.3.2 RVV-X对家兔凝血时间的影响[7] 家兔分组和给药剂量同2.3.1。先测定家兔的正常凝血时间作为自身空白对照,而后由耳缘静脉注射药物,给药后10 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h,用一次性注射器自耳中动脉取血1 ml置于长10 cm、内径1 cm的试管中(水浴恒温37℃),自血液进入注射器时开始计时,每15s将试管倾斜一次,观察血液的流动性,直至血液全部凝固为止。
2.3.3 RVV-X对肝素化小鼠凝血时间的影响[8] 小鼠60只,随机分为6组,每组10只。分为生理盐水组、肝素化模型组、肝素化模型+立止血0.025KU/kg组、肝素化模型+RVV-X0.01 u/kg、0.0025 u/kg、0.000625 u/kg三个剂量组。小鼠尾静脉注射7 u/ml肝素生理盐水0.1 ml/10 g造模,30 min后静脉注射受试药,给药后30 min,摘除眼球采血0.5 ml置于试管中(水浴恒温37℃),每15 s将试管倾斜一次,观察血液的流动性,直至血液全部凝固为止。
2.3.4 统计学方法 量反应资料数据均以平均值±标准差(x±s)表示,根据实验结果分别采用组间t检验和给药前后自身对照的t检验。
图1
广西圆斑蝰蛇毒过HiPrep 16/10 DEAE FF阴离子交换柱色谱
图2
组分V过Superdex G-75凝聚过滤柱色谱
图3
RVV-X的SDS-PAGE电泳图谱
Lane 1为标准蛋白;Lane 2为组分V;Lane 3为非还原性RVV-X;Lane 4为还原性RVV-X
3 结果
3.1 RVV-X的分离纯化和鉴定
广西圆斑蝰蛇毒粗毒经DEAE FF阴离子柱层析后获得六个蛋白峰,对各峰进行活性测定,发现V峰在有Ca.2+存在时能显著缩短血浆复钙化时间,在无Ca.2+存在时不能使血浆凝固,其凝血活性具有钙依赖性,含有RVV-X,见Fig1。用SuperdexG-75对V峰进行凝胶过滤,获得四个蛋白峰,发现组分A具有相同活性(见表2)。
3.2 RVV-X的纯度鉴定和分子量测定
RVV-X经10%SDS-PAGE电泳在非还原性条件下呈单一蛋白条带,分子量约为97.8KDa,在还原性条件下呈二蛋白条带,重链分子量约76.3kDa,轻链分子量约21.5kDa。提示此蛋白质由两条肽链组成,它们之间通过二硫键连接。
3.3.1 RVV-X对家兔肝创伤出血模型出血时间及出血量的影响 采用家兔肝创伤出血模型观察RVV-X的止血效果,RVV-X 0.02 u/kg、0.005 u/kg及0.00125 u/kg三个剂量组与用药前相比均能显著缩短出血时间、减少失血量,且作用呈现一定的量效关系(见表1、2)。
3.3.2 RVV-X对家兔全血凝固时间的影响 静脉注射RVV-X 0.02 u/kg、0.005 u/kg及0.00125 u/kg 10 min后,家兔凝血时间与给药前相比均显著缩短(P 模型组-5.25±0.33
立止血组0.0253.48±0.30.**
RVV-X组0.013.70±0.28.**
0.00254.88±0.27.*
0.0006255.23±0.42
注:与模型组相比.*P
