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【摘要】目的：探讨新Y染色体DYS718基因座在山西汉族群体中遗传多态性的应用价值。方法：在Y染色体基因组DNA中查找候选的基因座，用GenBank中的引物序列进行PCR扩增，再用银染方法显带。对其筛选的等位基因测序，构建等位基因分型标准物；按照ISFG原则命名各等位基因。结果：本研究选择了Y染色体基因座DYS718。在116例山西汉族无关男性个体血样中共检出了4个等位基因。其基因多样性为0.6782，在法医学应用方面，其个人识别能力（DP）和非父排出率（PE）均为0.6782。结论：新Y染色体基因座DYS718具有较高的遗传多态性，在法医学及人类遗传学方面具有应用价值。
【关键词】短串联重复序列；STR；Y染色体；DYS718；山西；汉族人群
文章编号：1009-5519（2008）12-1781-02 中图分类号：R446 文献标识码：A
Y染色体遗传标记具有男性特有、父系遗传及单倍型遗传的三大特征[1~3]，其独特性与STR位点分型检测的优越性相结合成为法医学个体识别和父权鉴定中的新工具。但由于Y染色体遗传标记的多态性远较常染色体基因座低，因此需要寻找更多具有多态性的Y-STR［Y-specific Short tandem repeats或称Y染色体微卫星DNA microsatellites，它是存在于人类Y染色体非重组区（non-recombining region，NRY）的短串联重复序列］来满足研究的需要。本研究首次选取了新Y-STR基因座DYS718，利用GenBank中的引物序列，建立适当的PCR扩增条件，调查该基因座在山西汉族人群中的频率分布及遗传多态性，并对其在法医学中的应用作初步探讨。
1 材料与方法
1.1 血样和DNA的提取：116例山西汉族无关男性个体和20例女性个体血样，取外周血0.5 ml，用EDTA抗凝，DNA提取采用酚-氯仿有机溶剂法：TKM1（10 mmol/L Tris-HCL，pH=7.4; 10 mmol/L KCl; 10 mmol/L MgCl2; 2 mmol/L EDTA，pH=8.0）破坏红细胞[4]， 2×蛋白酶K消化液（20 mmol/L Tris-HCL，pH=7.6；20 mmol/L
EDTA，pH=8.0；300 mmol/L NaCl;1% SDS）和蛋白酶K（100 μg/mL）破坏白细胞；55 ℃水浴3～5 h，亦可37 ℃过夜；酚-氯仿抽提，无水乙醇沉淀，最后溶于去离子水中，-20 ℃保存备用。
1.2 引物序列：引物序列参照基因库，由TaKaRa公司合成（见表1）。
1.3 目标DNA片段扩增，电泳分离及显色：25 μl的PCR反应体系包含：50～100 ng基因组DNA，2.5 μl 10×PCR缓冲液（含1.5 mmol/L Mg2+），200 μmol/L dNTP， 1U Taq DNA聚合酶（博迈德，北京），引物各0.3 μmol/L。热循环仪采用T1 Thermocycler(Biometra，德国)。热循环参数如下：94℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸 50 s，共36个循环；72 ℃ 延伸10 min。非变性聚丙烯酰胺垂直电泳分析PCR扩增产物，胶浓度为8%，交联度为3.3%，过硫酸铵-TEMED系统催化聚合。1�TBE缓冲液，恒压380 V，电泳时间5 h。银染显带，做成干胶。
1.4 等位基因梯阶（allelic ladder）的制备与命名：筛选出不同等位基因分型的样本进行PCR扩增，然后将其扩增产物混合制成等位基因分型梯阶。各等位基因委托北京博迈德公司测序（ABI PRISM 3730 DNA自动测序仪测序），得到重复序列并按国际法医血液遗传学会DNA委员会（ISFG）推荐的原则命名[6]。
1.5 数据分析：通过直接计数法计算各等位基因的频率。基因多样性（GD）按照公式 GD=［n(1－∑Pi2)］/(n-1)计算，其中 Pi 为单倍型频率；其标准误（S.E.）按照公式S.E.=｛［2∑Pi3 －2（∑Pi2）2］/n｝1/2，n为所检验的样本数量，Pi为等位基因频率。根据Y染色体的遗传特点，用和计算GD相同的方法分别计算个人识别能力(power of discrimination，DP)和非父排除率(power of exclusion， PE)。
2 结果
2.1 序列结构及定位：测序结果表明：该基因座为简单重复，重复片断为tta，重复次数分别为14，15，16，17；按照ISFG推荐的命名标准，将等位基因分别命名为14，15，16，17[7]。
2.2 等位基因分型和频率：116例山西汉族无关男性个体在新Y-STR基因座DYS718共检测到4个等位基因，其多态性信息见表2，频率分布及群体遗传学参数见表3；且20例女性DNA样品，未见PCR扩增产物，说明其引物有很好特异性。
2.3 电泳分析：用自制的等位基因梯阶进行了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分型，测序表明DYS718的各等位基因之间的距离为相差4个碱基的重复序列；三联体和二联体中女性均无特异性扩增条带，且三联体中父子在该基因座的等位基因分型一致，但仍不能排除基因突变，对该基因座的基因突变应作进一步的研究。
3 讨论
DYS718重复序列为tta，属于简单重复序列。本次实验一共检出4个等位基因，片段长度在205bp~214bp之间，基因频率在0.1034~0.4138之间，最常见的等位基因为16，其等位基因频率为0.4138，法医学上的DP和PE均为0.6782。该基因座有较高的基因多样性且易于扩增，特异性好，分型明确，扩增片段200bp附近，有利于降解检材的分型。
男性特有的Y-STR基因座信息在法医检案中更具有实际意义，如性犯罪案件、亲子鉴定、检验混合斑中有几个男性存在等。亲权鉴定方面，用于同父异母、兄弟鉴定、叔侄鉴定以及缺乏父亲的亲权鉴定[8，9]，解决了常染色体STR面临的困境。本研究通过PCR技术，结合PAGE电泳，以及银染显色，在山西汉族人群乃至国内首次调查了新DYS718基因座的多态性分布情况，为以后的实际检案提供了参考依据，并为全国Y-STR数据库的建立提供数据。该Y-STR基因座应该在法医学和人类遗传研究等方面具有较高的应用价值，值得推广应用。另外本研究未发现突变现象，但Y-STR同常染色体STR基因座一样，也有一定的突变率。Manfred等对DYS19等15个Y-STR基因座进行突变率的研究，平均突变率估计为2.80×10-3，与常染色体STR突变率相似（2.10×10-3）。单个基因座的鉴别能力有限，因此，该基因座是否存在突变以及联合其他基因座的检验还有待进一步研究。
参考文献：
[1] Jobling MA，Tyuler-Smith C. Fathers and sons：the Y chromosome and human evolution[J].Trends Genet，1995，11：449.
[2] Sykes B，Irven C.Surnames and the Y chromosome[J].Am J Hum Genet，2000，66 :1417.
[3] 赵瑞君，赵仰星，李冒华，等. TKM-血液DNA快速提取法[J].山西医学院学报，1996，27（1）：4.
[4] DNA recommendations.Report concerning further recommendations of the DNA commission oftheISFHregarding PCR-based polymor-phisms in STR (short tandem repeat) systems[J].Int J Legal Med，1994，107:159.
[5] 张更谦，王 艳，张艳霞，等. 新Y-STR DYS605在山西汉族人群中的多态性分布[J].遗传HEREDITAS（Beijing），2004，26(3):295.
[6] Li W，Hu L，Chen S，et al.10 Y-STRs haplotypes in Chinese [J].For-ensic Sci Int，2003，139:85.
[7] Dobashi Y，Kido A，Fujitani N，et al.Y-chromosomal STR haplotypes in a Bangladeshi population [J].Legal Med，2005，7:122.
收稿日期：2008-03-10 修回日期：2008-04-01
