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[摘要] 目的 探讨宫颈浸润癌组织中Skp2、p27和CyclinE的表达及相关性，以及与临床病理因素和预后的关系。 方法 采用免疫组化二步法检测70例宫颈癌中Skp2、p27和CyclinE的表达，并分析三者的表达与宫颈癌临床病理因素及预后的关系，同时探讨三者在宫颈癌中表达的相关性。 结果 ①Skp2和CyclinE在宫颈癌中的阳性表达率分别为57.1%和64.3%，并随着肿瘤分化程度的降低表达增高（P＜0.05），与浸润深度、脉管浸润、淋巴结转移显著相关（P＜0.05），与年龄、临床分期、癌灶大小无关（P＞0.05）。两者的高表达5年生存期明显低于其低表达（P＜0.05）。P27在宫颈癌中的阳性表达情况与以上两者相反。②Skp2、CyclinE和P27呈负相关（P＜0.01）；Skp2和CyclinE呈正相关（P＜0.01）。 结论 Skp2和CyclinE蛋白高表达可能是宫颈组织恶变的重要生物学标志，Skp2、CyclinE高表达，伴P27低表达提示肿瘤的高侵袭性及不良预后。
[关键词] 宫颈癌；Skp2蛋白；P27蛋白；CyclinE蛋白；免疫组化
[中图分类号] R737.25 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）35-01-04
Expressions of Skp2,P27 and CyclinE Proteins and Their Correlations with Clinicopathological Features of Invasive Cervical Carcinoma
WU Honglian1 LV Jieqiang2
1.Department of Obstetrics and Gynecology, Wenzhou Medical Affiliated the Sixth Hospital Lishui City People"s Hospital，Lishui 323000，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology, Wenzhou Medical Affiliated the Second Hospital，Wenzhou 325027，China
[Abstract] Objective To learn the expression of Skp2，p27 and CyclinE in the lesions of invasive cervical carcinoma（ICC），and their relationships with the clinicopathological features and prognosis of this certain disease. Methods Expressions of Skp2，p27 and CyclinE were measured by immunohistochemical technique in 70 cases invasive cervical carcinoma.In addition，the relationship of Skp2，p27 and CyclinE expression with clinicopathological features and prognosis of ICC was then analyzed. Results ①The Skp2 and CyclinE positively expressed rate in ICC was 57.1% and 64.3%.The expression increased as the tumor differentiation decreasing. The expression of Skp2 and CyclinE had strong correlation with the tumor infltrating depth，intravascular involvement and lymph node metastasis（P＜0.05），while no obvious relationship with age，clinical stage or tumor size（P＞0.05）. The 5-year survival rate of ICC in positive Skp2 and CyclinE higher expressed group was remarkably lower than those of lower expressed group，which indicated a strong relationship of Skp2 and CyclinE expression with cervical carcinoma prognosis（P＜0.05）. The P27 expression in cervical carcinoma in the opposite situation with the Skp2 and CyclinE. ②The interrelation of Skp2，P27 and CyclinE protein expressed in ICC：the Skp2 and CyclinE expression in cervical carcinoma had negative correlation with P27 expression（P＜0.01）. There was strongly positive relation between Skp2 and CyclinE expression in ICC（P＜0.01）. Conclusion Over expression of Skp2 and CyclinE along with low expression of P27 may indicate higher invasive tendency of tumor and poor prognosis.
[Key words] Invasive cervical carcinoma；Skp2 protein；P27 protein；CyclinE protein；Immunohistochemistry
宫颈癌是我国女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁妇女健康。细胞周期调节失控导致细胞无限制生长，从而引起肿瘤。有关Skp2、P27和CyclinE在肿瘤中的表达已有研究报道，但联合检测三者在宫颈癌中的表达尚未见报道。本文旨在探讨细胞周期调控因子Skp2、P27和CyclinE在宫颈癌中的表达，及与临床病理因素间的关系及两两间的关系。
1对象与方法
1.1研究对象
选取我院2002年1月～2005年1月病理科确诊并存档的手术切除宫颈鳞癌石蜡包埋组70例，具有完整的临床、病理及随访资料。所有病例均为初治者，术前均未接受放射治疗或化学治疗。其中年龄35～67岁，平均年龄47.5岁，＜45岁31例，≥45岁39例。按病理学分级：≤Ⅱ级29例，Ⅲ级41例。按FIGO标准分期：Ⅰa期16例，Ⅰb期17例，Ⅱa期17例，Ⅱb期20例。局部癌灶大小：＜4cm 38例，≥4cm 32例。根据术后病理肌层浸润程度：≤浅肌层28例，＞浅肌层42例；伴脉管浸润 29例，无脉管浸润 41例；发生淋巴结转移者19例，无淋巴结转移者51例。另选取50例正常宫颈组织作为对照。
1.2 实验方法
采用免疫组织化学二步法分别检测标本中Skp2、P27和CyclinE的表达，以购买的阳性片免疫组化染色结果为阳性对照。以PBS 替代第一抗体的免疫组化染色结果为阴性对照。
1.3 试剂
浓缩型鼠抗Skp2单克隆抗体、即用型P27鼠抗单克隆抗体、CyclinE鼠抗单克隆抗体、SP免疫组化染色超敏试剂盒购自福建迈新生物技术公司。
1.4实验步骤
按说明书操作，石蜡切片经过二甲苯脱蜡→梯度酒精脱水→抗原修复→柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复→过氧化物酶阻断溶液阻断内源性过氧化物酶→封闭非特异性抗原→加一抗→过夜→二抗→三抗（链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液）→DAB染色→苏木素复染→脱水、透明→封片。
1.5 结果判断
免疫组化切片在光镜下按统一放大倍数（×400倍），以组织切片中细胞核染为棕褐色或棕黄色者为阳性细胞标志。
1.6 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 Skp2、CyclinE在ICC、CIN及NCE中的表达
Skp2、CyclinE 的阳性表达位于细胞核。在低分化ICC细胞核中呈强阳性，在CIN中呈阳性或弱阳性，在NCE中呈阴性，偶见弱阳性表达，见图1A、B、D。从NCE→CIN→ICC，Skp2和CyclinE蛋白的阳性表达率逐渐升高，见表1。ICC中Skp2和CyclinE表达与组织学分级、间质浸润、盆腔淋巴结转移和脉管浸润显著相关，两者的阳性表达率显著增高，见表2。Skp2和CyclinE蛋白阳性表达组的5年生存率明显低于其阴性表达组（P＜0.05），见图2、图4。
2.2 P27在ICC、CIN及NCE中的表达
在NCE组中P27阳性表达多数位于表层分化完毕的细胞核中，胞浆弱表达，见图1C，而在ICC组中胞核呈阳性表达，胞浆弱表达。从ICC→CIN→NCE，P27阳性表达率逐渐升高，见表1。在淋巴结转移阳性、脉管浸润阳性及间质浸润（＞浅肌层）中，P27阳性表达率显著降低，见表2。P27蛋白阳性表达组的5年生存率明显高于其阴性表达组（P＜0.05）。见图3。
2.3 宫颈癌中Skp2、P27及CyclinE的表达与预后的关系
根据随访资料，Skp2和CyclinE高表达、P27低表达者5年生存期明显低于Skp2和CyclinE低表达、P27高表达者，两组统计学比较有显著性差异（P＜0.05）。见表3。Skp2和CyclinE表达阴性、P27表达阳性患者预后明显优于Skp2和CyclinE表达阳性、P27表达阴性者，见图2～4。
2.4 ICC中Skp2、P27及CyclinE表达的相关性
经Spearman等级相关分析发现，ICC中Skp2与P27蛋白表达呈显著负相关（r=-0.458，P＜0.01）。Skp2与CyclinE蛋白表达呈显著正相关（r=0.763，P＜0.01）。P27与CyclinE蛋白表达呈显著负相关（r=-0.504，P＜0.01）。
3 讨论
3.1 Skp2在宫颈癌中的表达及意义
Skp2是Zhang等[1]于1995年从大量的恶变细胞中发现的一种能与S期激酶cyclinA-CDK2相互作用的蛋白，故命名为Skp2（S-phase kinase-associated proteins）。何春年[2]等研究显示：Skp2 在NCE中表达很低，在CINⅠ中表达明显增高。大量研究表明，Skp2在多种恶性实体肿瘤中常呈高表达，且提示预后不良。本研究中，我们检测到Skp2在ICC中阳性表达率为57.1%，与Dowen等研究结果相似。Skp2在ICC中的阳性表达率高于CIN及NCE，在CIN中的阳性表达率也高于NCE，表明Skp2高表达与宫颈癌密切相关，可能与Skp2泛素化降解P27，导致细胞无限制通过G1/S期转换“关卡”，无限制的分裂增殖，形成恶性克隆，最终导致肿瘤发生[3]。为进一步探讨Skp2在宫颈癌发展进程中的作用，我们分析了Skp2蛋白的表达与临床病理因素之间的关系，结果显示，Skp2的阳性表达率与临床分期、患者年龄及癌灶大小无明显关系，而与肿瘤分化程度、淋巴结转移、间质浸润深度和脉管浸润显著相关，以上提示Skp2的高表达使得肿瘤具有更强的侵袭性。另外从本研究中还发现Skp2高表达者5年生存期明显低于Skp2低表达者，且Skp2阴性表达组的预后明显优于阳性表达组，以上均提示Skp2阳性表达或高表达者，癌细胞具有更强的侵袭性，且预后差。
3.2 P27在宫颈癌中的表达及意义
P27作为细胞周期负性调控因子，广泛抑制各种细胞周期蛋白和激酶的活性，与肿瘤发生、发展及预后密切相关。在人类几乎所有的上皮性肿瘤中都有P27蛋白表达的下降或缺失，且随恶性程度的增加其表达呈下降趋势。在乳腺癌、食管癌、前列腺癌[4]等研究证实：P27蛋白的表达强度与肿瘤的组织学分级、生存期明显相关。本研究中P27蛋白在ICC→CIN→NCE的阳性表达率逐渐升高，与Skomedal等[5]在宫颈癌的研究结果相似，表明P27是宫颈癌的抑制因素，宫颈癌中P27的下调消除了对细胞周期的抑制，使细胞无限制的增殖，导致肿瘤发生。肿瘤的分化程度影响肿瘤的预后，本研究显示P27的表达随着肿瘤分化程度降低，阳性表达率逐渐下降，提示P27与肿瘤的生物学恶性行为有关。同时本研究结果显示，P27的阳性表达率与临床分期、患者年龄及肿瘤大小无明显关系，而与淋巴结转移、间质浸润深度和脉管浸润显著相关，其阳性表达率显著下降，可能与P27的下调降低细胞间的粘附能力，使肿瘤易于发生转移。另外从本研究中还发现P27低表达者5年生存期明显低于P27高表达者，并且P27阳性表达组预后明显优于阴性表达组，以上提示P27低表达或表达缺失与肿瘤的发生、恶性进展相关，并提示预后不良。
3.3 CyclinE在宫颈癌中的表达及意义
CyclinE是细胞周期G1期的正性调控因子，其过表达可促进细胞由Gl期进入S期，使正常细胞增殖失控导致肿瘤的发生，已被证实是一种癌基因。有学者在乳腺癌，胃癌[6]中均发现CyclinE基因的扩增出现在细胞癌变的早期。本研究中我们发现CyclinE在宫颈癌中的阳性表达率明显高于CIN及NCE，在CIN中的阳性表达率也高于NCE，由此推断CyclinE过表达参与ICC的发生及恶性进展。本研究中分析了CyclinE蛋白的表达与临床病理因素之间的关系，结果显示与Skp2蛋白表达相似，并随肿瘤组织学分化程度降低，其阳性表达率也呈现增高趋势。另外从本研究中还发现CyclinE高表达5年生存期明显低于CyclinE低表达，并且预后差。以上表明CyclinE的过度阳性表达与宫颈癌的发生发展密切相关，可能是影响宫颈癌分化、进展及淋巴结浸润机制的重要因素之一，并提示预后不良，其原因可能是CyclinE过度表达促使细胞通过Gl期进入S期，使细胞过度增殖失控而致肿瘤形成。
3.4 Skp2、P27和CyclinE在宫颈癌中表达的相互关系
本研究在ICC中显示：Skp2与P27蛋白表达呈负相关，Skp2与CyclinE蛋白表达呈正相关，p27 与CyclinE蛋白表达呈负相关。随着宫颈癌分化程度降低，Skp2、CyclinE的表达逐渐增高，而P27的表达逐渐降低。近年来，人们已经在人类多种实体恶性肿瘤如淋巴瘤中、卵巢肿瘤[7]中发现Skp2与P27之间呈负相关。Skp2是新发现的SCF多功能E3酶复合体中的一种F-box蛋白，通过泛素蛋白酶体途径降解P27，下调P27的表达，从而促进细胞增殖、异常分裂，导致恶性肿瘤的发生。
CyclinE是一种癌基因，主要在G1晚期发挥正性调控作用，通过与CDK结合，使CDK活化，促进细胞周期由G1期向S期转化。P27是一种细胞周期抑止剂，主要通过与cyclinE-CDK2的结合，抑制CDK的活性而发挥抑癌作用，阻止细胞进入S期而停滞于G1期，如二者失调将导致细胞增殖和恶变，提示它们之间可能存在负反馈调节机制。已有研究证实[8]，多种实体肿瘤中P27表达下调和CyclinE过度表达，可能是通过共同途径参与肿瘤的发生、发展，并认为联合两者的检测，有益于指导临床辅助治疗及筛选不良预后。
研究发现，CyclinE在多种肿瘤中有基因扩增及过表达，在肿瘤的发生、发展中起重要作用，并且已经被证实是一种癌基因。而Skp2由于在不同癌症细胞中的过表达和在多个实验室中被证实的致癌活性而被确定为癌基因。本研究提示，两者在宫颈癌中高表达可能起协同促进宫颈癌的发生、发展，并提示预后不良，其作用机制目前尚不明确，可能与P27表达下调相关，有待于进一步研究明确。
总之，本实验通过联合检测Skp2、P27和CyclinE在宫颈癌中的表达，提示Skp2、CyclinE的高表达和P27的低表达或表达缺失可能与肿瘤的发生发展关系密切，三者联合检测对判断宫颈癌的恶性倾向和评估预后具有重要的参考价值，为临床上进一步了解宫颈癌的生物学行为、判断预后、指导术后临床辅助治疗提供帮助。
[参考文献]
[1] Zhang H，Kobayashi R，Galaktionov K，et al. pl9Skpl and p45Skp2 are essential elements of the cuclin A-CDK2 S phase kinase[J]. Cell，1995，82（6）：915-925.
[2] 何春年，赵焕芬，徐翠清，等. 子宫颈鳞癌及 CIN 中视网膜母细胞瘤基因与SKp2表达的意义[J]. 现代肿瘤医学，2007，15（2）：234-237.
[3] Schulman BA，Csrrano AC，Jeffrey PD，et al. Insights into SCF ubiquitin ligases from the structure of the Skpl-Skp2 complex[J]. Nature，2000，408（6810）：381-386.
[4] Dreher T，Zentgraf H，Abel U，et al. Reduction of PTEN and p27Kipl expressioncorrelattes with tumor grade in prostate cancer. Analysis in radical prostatectomyh specimens and needle biopsies[J]. Virchows Arch，2004，444：509-517.
[5] Skomedal H，Kristensen Gb，Lie AK，et al. Aberrant expression of the cell cycle associated proteins TP53，MDM2，P27，cdk4，cyclin D1，RB，and EGFR in cervical carcinomas[J]. Gynecol Oncol，1999，53（2）：223-2288.
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[7] Sui L，Dong Y，Watanabe Y，et al. Clinical significance of Skp2 expression，alone and combined with Jabl and P27 in epithelial ovarian tumors[J]. Oncol Rep，2006，15（4）：765-771.
[8] Kim YT，Zhao M. Aberrant cell cycle regulation in cervical carcinoma[J].Yonsei Med J，2005，46（5）：597-613．
（收稿日期：2011-10-09）
