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【摘要】 目的 为观察缺氧对大鼠海马神经元的影响及纳络酮的保护作用。方法 采用细胞培养方法获取10～14 d的海马神经元，将含药血清加入到培养液中，4 h后建立95%N�2+5%CO2混合气体急性缺氧模型，胎盘兰染色细胞计数并做流式细胞仪检测以及酶法测定抗氧化酶（超氧化物歧化酶）的抗氧化能力及丙二醛、NO的含量。结果 离体条件下纳络酮可显著增强海马神经元的活性，降低其凋亡率及死亡率；提高细胞上清夜中超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛及NO的含量，且成量效比例关系。结论 纳络酮在体外有抗缺氧损伤的作用。其作用机制可能是通过抑制细胞凋亡，提高抗氧化酶的活力，清除自由基，而发挥作用。
【关键词】 纳络酮； 缺氧；海马神经元；抗氧化剂
The protectiveeffects of nalaxone in anoxic cultured natal hippocampal neuronal cells
QI Hua,QI Yan,LU Song.Qingdao Cancer Hospital，Qindao 266042,China
【Abstract】 Objective In order to investigate and confirm whether Nalaxone has the neuroprotective effect in anoxic cultured natal hippocampal neuronal cells.Mothods The present study used morphological changes and the activities of SOD and rhe contents of MDA and NO as indicators.The morphological changes was observed by trypan blue method，The apoptosis rate and death rate of hippocampal neuronal was tested by using flow cytometry（FCM）.The contents of MDA and NO and the activities of SOD in the supernatants of cells were determined by biochemical methods.Results The results demonstrated that：in vitro，comparing with the control group，Nalaxone significantly increased the activities of hippocampal neuronal cells，decreased the apoptosis rate and the death rate，increased the activities of SOD and decreased the contents of MDA and NO in the supernatants of cells.Conclusion The above results suggest that：the Nalaxone has the neuroprotective effect on hippocampal neuronal cells against anoxic.The mechanism of this effects of Nalaxone may be mediated by eliminating the free radicals，by increasing the activities of antioxidative enzymes to inhibit the oxidative damages caused by anoxic.
【Key words】 Nalaxone；Anoxic；Hippocampal neuronal cells；Antioxidants
脑缺血时机体产生大量的氧自由基，且NO在体内局部浓度升高，与周围的氧自由基等反应而生成活性氮氧化合物，是一种强氧化剂，也可启动脂质过氧化。自由基医学的研究表明，神经元的损伤、凋亡、坏死等与脂质过氧化密切相关，而抗氧化剂可通过清除自由基，提高抗氧化酶等途径有效的阻断或防止这一过程［1］。近年发现纳络酮还具有非拮抗阿片受体作用，对稳定脑出血后神经元有一定的作用，但目前还缺乏对海马神经元培养的相关实验支持［2］。本试验体外培养海马神经元，建立急性气体缺氧模型，胎盘兰染色细胞计数并做流式细胞仪检测以及酶法测定抗氧化酶（超氧化物歧化酶）的抗氧化能力及丙二醛、NO的含量。以此来探讨纳络酮在体外是否有抗缺氧损伤的作用，其作用机制是否是通过抑制细胞凋亡，提高抗氧化酶的活力，清除自由基，而发挥作用的。从而来确定纳络酮在脑缺血中的神经元保护作用，并寻求预防和治疗脑缺血发生的药物。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物为新生的Wister大鼠，由青岛大学实验中心提供。
1.1.2 试剂 尼莫地平（德国拜耳公司），DMEM、马血清（Gibco公司），胎牛血清（杭州西季青生物材料工程公司），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MAD）、一氧化氮（NO）（南京建成生物工程研究所），多聚赖氨酸（Sigma公司）。
1.1.3 主要仪器设备 OLYMPUS，BX50，PM-20系统显微镜（日本），PM-6，OLYMPUS解剖显微镜（日本），二氧化碳细胞培养箱（上海福玛实验设备有限公司），YJ超净工作台（垂直单向流型）（苏州市洁净技术研究所）。
1.2 方法
1.2.1 海马神经元的培养
按已有的细胞培养方法［3］，取新生1~3 d的Wister大鼠，消毒，断头，分离出双侧海马，剪碎成1 cm×1 cm×1 cm的组织块，加入1.25 g/L胰酶消化30 min（中间轻轻振荡几次），用含有10%胎牛血清及10%马血清的种植培养液终止胰酶的作用。制成细胞悬液（1.0×106 /ml）接种到六孔板中（2 ml /孔），37℃5%CO2培养箱中培养24 h后更换维持培养液（5%胎牛血清、10%马血清），以后每3 d半量换液一次，第4~5天加入阿糖胞苷，终浓度为5 mg/L。接种10~14 d的海马神经元用于本实验。
1.2.2 尼氏染色鉴定神经元 将培养的海马神经元经0.02 mol /L PBS（pH7.4）漂洗1~2次，4%中性福尔马林溶液固定1 h，PBS漂洗后，1%甲苯胺蓝染液中染色20 min，95%乙醇分色，37℃干燥，二甲苯透明，中性树脂封片。
1.2.3 分组及给药 接种10~14 d的海马神经元分为4组：对照组；尼莫地平5 umol/L组；加入5%、10%纳洛酮组。每组4个六孔板，将所用药物加入到细胞培养液中进行孵育。
1.2.4 缺氧模型的制备［4］
4 h后将已分组给药的培养板移入37℃恒温密闭容器中，连续充以95%NO2+5%CO2混合气体，流速为20 ml/min，持续1 h。
1.2.5 海马神经元细胞凋亡率的检测
将上述处理过的细胞制成单细胞悬液，1000转/min离心10 min，摒上清，PBS冲洗，70%乙醇固定，400目的筛网过滤，加PI染液，上流式细胞仪检测。
1.2.6 海马神经元上清液中SOD、MDA、NO的测定
按试剂盒说明书的要求先求出样本的最佳加样量；海马神经元经上述同样处理后，取细胞上清液，按试剂盒说明书的要求操作，测定各样本的吸光度，并依下列公式计算出SOD，MDA，NO的含量。
SOD 活力（U /ml）=（对照管吸光度－测定管吸光度）/对照管吸光度÷50%×反映体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数。
MDA 含量（nmol /ml）=（测试管吸光度－测定空白管吸光度）/（标准管吸光度－标准空白管吸光度）×标准品浓度（10 nmol /ml）×样本测试前稀释倍数。
NO含量（umol /L）=（测试管吸光度－空白管吸光度）/（标准管吸光度－空白管吸光度）×标准品浓度（100 umol /L）×样本测试前稀释倍数。
1.3 统计学方法
用简明统计（cs2000）软件对实验结果先进行正态分布，方差齐性检验，若方差不齐，则进行F′检验；若方差齐，则进行F检验。结果以均值±标准差（x±s）表示。
2 结果
2.1 细胞存活率的计算
分离出的海马细胞在接种之前，制备106/ml细胞悬液，用0.2%的台盼蓝染色，计数着色细胞和未着色细胞数，活细胞数为97%左右。
2.2尼氏染色结果 光学显微镜下可见海马神经元胞质淡蓝色，尼氏体及核仁明显呈深蓝色。
2.3 纳洛酮对缺氧所致的海马神经元抗氧化酶活性及MDA、NO含量的影响
对照组的SOD含量最低（P＜0.01），MDA及NO的含量则明显最高（P＜0.01）；尼莫地平及纳洛酮低、高剂量组SOD活性则依次升高，MDA及NO的含量则依次降低。结果见表1。
2.4 流式细胞仪检测海马神经元凋亡率 流式细胞仪测定PI荧光强度，分析各组细胞的凋亡率：对照组凋亡率明显高于其它各组。结果见表2。
3 讨论
脑缺血或脑缺氧的研究中，人们发现海马是脑内对缺血、缺氧最为敏感的部位之一。采用新生大鼠海马神经元细胞培养模型，该模型可直接研究药物对神经细胞缺氧损伤的机制。通过加入阿糖胞苷，可有效地抑制胶质细胞的生长，保证神经元的纯度［5］。本实验分离的细胞经胎盘蓝染色检查，成活率达95%以上。
尼氏体（Nissl bodies）常也被称为嗜色小体或虎斑，主要成分有核糖核酸（RNA）和蛋白质组成。由于含有RNA，易被某些碱性苯胺染料所染色，如甲苯胺蓝。由此可以用来证明所培养的细胞中神经元占90%以上，可以认为是相对纯的神经细胞培养［6］。脑缺血是临床上常见的一种疾病，细胞凋亡（apoptosis）无论是在短暂性脑缺血，还是在永久性脑缺血中均是神经细胞死亡的主要形式［7-8］。本实验采用PI单染法，通过流式细胞仪检测发现：对照组细胞凋亡率较其余三组升高（表2）。这说明缺氧能够引起细胞凋亡，而纳洛酮能够抑制这种缺氧所引起的凋亡。
正常情况下体内产生少量自由基属生理范围，可被抗氧化防御系统清除，使自由基的产生及清除处于动态平衡状态。当急性缺氧时，此平衡状态被打破，自由基积蓄从而造成脑损伤。其中MDA含量的高低就可以反映机体内脂质过氧化的程度和细胞损伤的程度。试验中，对照组的含量最高，给药组则依次降低（P＜0.01），说明缺氧损伤了细胞，这与文献报道一致［9］。而纳洛酮有抗缺氧损伤的作用。机体的防御系统中主要有超氧化物歧化酶（SOD），其活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，常与MDA相配对作为检测机体氧化程度的指标。试验中，对照组中SOD明显降低，其余3组则依次升高（P＜0.01），说明缺氧抑制了SOD的活性。这与MDA的结果相一致（表1），说明纳洛酮可通过抑制脂质过氧化发挥抗缺氧损伤的作用。
NO在脑缺血损害中所起的作用，一直是研究的重点。近来研究发现，在脑缺血损伤过程中神经细胞中的NO合酶NOS过度表达，可催化产生NO，有超氧阴离子自由基（O2）存在时，迅速与其反应生成氧化毒性更强的过氧亚硝基（ONOO2）引起脂质过氧化反应，在损伤早期起关键作用［10］。本实验表明：纳洛酮组的NO含量明显低于其他各组（P＜0.01）（表1），这说明缺氧损伤细胞造成NO升高，而纳洛酮可明显抑制其含量从而来保护细胞免受缺氧损伤。
综上所述，纳洛酮有抗缺氧损伤的作用，其作用机制可能是：抑制细胞凋亡，提高抗氧化酶的活性，清除自由基。
参 考 文 献
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［5］ 申军现，金卫林，鞠躬.低密度体外培养大鼠海马神经元的形态学观察.第四军医大学学报，2003,24（6）：489-491.
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［7］ Murakami K，Nivzhe H，Wang T，et al.Advances in apoptosis research. Brain Res,1997，751:160-165.
［8］ Nitatori T,Sato N,WaguriＳ,et al.Delayed neuronal death in the CA1 pyramidal cell layer of the gerbil hippocampus following transient ischemia is apoptosis. J Neuro Sci,1995,15:1001-1011.
［9］ 王晓英,罗嘉,邢虹,等.神经元缺氧抚养损伤时氧自由基的毒性作用及其机制.生物物理学报,1999, 15(2)：375-380.
［10］ HARA H，AYATA C.［3H］-L-NG-nitroarginine binding after transient focal ischemia and NMDA-induced excitotoxicity in tger I ang typer III metric oxide synthase null mice. J Cereb Blood Flow Metab，1997，17（5）：515-526.
