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【摘要】目的：对枸橼酸钾溶液微生物限度检查法可行性进行验证。方法：根据《中国药典》2005版二部附录Ⅺ J微生物限度检查法常规法进行验证试验。结果：试验组的菌回收率均大于70%，控制菌常规法验证阳性菌检出，阴性菌未检出。结论：枸橼酸钾溶液微生物限度检查法符合《中国药典》2005版二部附录Ⅺ J微生物限度检查法的规定。
【关键词】枸橼酸钾溶液；微生物限度检查；验证
文章编号：1009-5519（2008）11-1716-02 中图分类号：R9 文献标识码：B
枸橼酸钾溶液为本院自制制剂，用于碱化尿液，纠正酸中毒以及低血钾症的钾离子补充。在国家加强药品管理的大背景下，按照《中国药典》2005版的要求，对其微生物限度检查法进行验证，作为制剂审批的重要材料。
1 仪器与试药
1.1 药品：枸橼酸钾溶液，500 ml/瓶，批号：070822，070927，
071009南通大学附属医院制剂室（苏药制字H04000176）。
1.2 菌种：大肠埃希菌[CMCC（B）44102]第三代、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]第三代、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]第三代、白色念珠菌[CMCC (F) 98001]第三代、 黑曲霉[CMCC(F)98003]第三代。以上菌种均由中国药品生物制品检定所提供。
1.3 培养基：（1）营养琼脂培养基（批号071010）；（2）玫瑰红钠琼脂培养基（批号070712）；（3）营养肉汤培养基（批号070906）；（4）胆盐乳糖培养基（批号070426）；（5）乳糖胆盐发酵培养基（批号070511）；（6）MUG培养基（批号070727）；（7）麦康凯琼脂培养基（批号070328），由北京三药科技开发公司提供。
1.4 稀释液：pH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（北京三药科技开发公司，070711）。
1.5 仪器设备：（1）生化培养箱，型号：SPX-150，生产厂商：上海申贤恒温设备厂，温控范围：30~35 ℃；（2）立式霉菌培养恒温箱，MJ-160B型，上海荣丰科学仪器厂生产，温控范围：23~28 ℃；（3）隔水式电热恒温培养箱，PYX-DNS-35×40型，上海医疗器械厂生产，温控范围：（36±1）℃。
2 方法
依据《中国药典》2005版二部附录Ⅺ J微生物限度检查法验证试验。
2.1 菌落计数方法的验证
2.1.1 菌液制备：（1）取经（33±1）℃培养24 h，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的肉汤培养物1 ml+9 ml 0.9%的无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-7、枯草芽孢杆菌的肉汤培养物1 ml+9 ml 0.9%的无菌氯化钠溶液，10倍稀释至10-5，细菌数约为50～100 cfu/ml的菌悬液，做活菌计数备用。（2）取经（25±1）℃培养39小时的白色念珠菌改良马丁培养物1 ml+9 ml 0.9%的无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至10-6，含菌数约为50～100 cfu/ml的菌悬液，做活菌计数备用。（3）取经（25±1）℃培养1周的黑曲霉改良马丁斜面培养物，加5 ml 0.9%的无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，并过滤孢子悬液至无菌试管内，吸取3 ml孢子悬液加2 ml 0.9%的无菌氯化钠溶液混匀，然后用无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至10-6，含孢子数约为50～100 cfu/ml，做活菌计数备用。
2.1.2 供试液制备：准确吸取枸橼酸钾溶液10 ml，置无菌三角瓶中，加入90 ml稀释液（pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液），充分混匀，即为1∶10的供试液。
2.1.3 菌落计数方法：平皿法计数。验证试验进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。（1）试验组：取1∶10供试液1 ml，分别注入10个平皿中，再依次加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种菌的菌悬液1 ml（含50～100 cfu），每株菌平行制备2个平皿，立刻倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别置30～35 ℃培养48小时和23～28 ℃培养72小时。（2）菌液组：分别取上述稀释的菌液1 ml注入平皿内，每个菌株平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。（3）供试品对照组：取1∶10供试液1 ml，分别注入4个平皿中，立刻倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，每种培养基制备2个平皿，分别置30～35 ℃培养48小时和23～28 ℃培养72小时。以测定供试品的本底菌数。试验结果见表1。
以上试验结果表明：采用平皿法（常规法）检验枸橼酸钾溶液，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率均大于70%。因此，枸橼酸钾溶液的细菌数、霉菌及酵母菌数的测定可采用平皿法进行。
2.2 控制菌检查方法的验证：大肠埃希菌检查方法的验证：（1）试验组：吸取1∶10供试液10 ml，分别接种至100 ml和200 ml的胆盐乳糖增菌培养基内，加入82 cfu大肠埃希菌，（36±1）℃培养18～24小时，均可见培养基混浊，有气体产生，然后分别取上述培养液0.2 ml接种至含5 ml MUG培养基的试管内培养，于5小时、24小时在366 nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照，观察结果，管内培养液均呈现荧光，为MUG阳性；然后沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面均呈现玫瑰红色，为靛基质阳性。本底对照为MUG阴性和靛基质阴性。（2）阴性菌对照组：吸取1∶10供试液10 ml及68 cfu金黄色葡萄球菌，分别接种至100 ml和200 ml的胆盐乳糖增菌培养基内，（36±1）℃培养18～24小时，培养基内均无混浊与气体产生。分别取上述培养液0.2 ml接种至含5 ml MUG培养基的试管内培养，于5小时、24小时在366 nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照，观察结果，管内培养液均未呈现荧光，为MUG阴性；然后沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面均呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照为MUG阴性和靛基质阴性。（3）结果判断：上述方法试验组MUG阳性、靛基质阳性，检出大肠埃希菌；阴性菌对照组MUG阴性、靛基质阴性，未检出金黄色葡萄球菌。说明用100 ml胆盐乳糖增菌培养基可以用于枸橼酸钾溶液大肠埃希菌的检查。
收稿日期：2008-02-25
