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【摘要】对本实验室提取的川产天麻多糖粗提液进行分离纯化,研究结果表明:采用酶法除蛋白效果比较理想,一次就能达到比较好的效果,胰蛋白酶用量为2.0U/mg,处理时间以5h最好;酶解结合一次Sevag法再醇沉后,蛋白脱出率为90.1%;进样体积8ml、样品浓度4%、流速0.8ml/min时,Sepharose 6 Fast Flow凝胶分离效果最好。
【关键词】天麻;多糖;纯化
【中图分类号】R282.71【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)14-102-2
Purification of Gastrodia elata BL Polysaccharides
ZHU Xiao-xia,Zhang yong
(School of Material Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Sichuan Mianyang,621010)
Abstract:The results of methods(Sevag,enzyme and enzyme decomposition with Sevag)showed that:Enzyme method is the best one to eliminate protein with dosage of enzyme 2.0U/mg for 5 hours.Enzyme decomposition with Sevag,then precipitated with ethanol.Remove rate of protein is 90.1%。The separation conditions of Sepharose 6 Fast Flow gel are 8ml 0f sample volume,4% of samples concentration 4%,and the velocity of 0.8ml/min.
Key word:Gastrodia elata BL;polysaccharides;purification
糖类物质是地球上数量最多的一类有机化合物,可广泛应用于医药、保健品及功能食品,作为绿色生物医药产品具有广阔的市场前景[1]。目前多糖产品开发相当热门,也卓有成效。多糖的生理功能与其纯度和化学结构有着重要的关系,多糖的提取纯化是其研究的基础。活性多糖的分离纯化是指获得粗的活性多糖提取液后,除去共存杂质,进行混合糖的相互分离。微生物多糖去蛋白常采用Seveag法、三氟三氯乙烷法;植物多糖去蛋白[2]常用三氯乙酸法,也可以用蛋白质水解酶使样品中的蛋白质部分降解后,再用Seveage法效果会更好。多糖的分离一般主要有分级沉淀、季铵盐沉淀法、透析法、金属盐沉淀法和制备性区域电泳等,但目前大多采用DEAE-凝胶(二甲氨基乙基凝胶)或其他各种不同类型的凝胶柱层析以及离子交换色谱法[3],根据文献和考虑到多糖的性质,宜采用凝胶柱层析技术进行分离。本文对天麻多糖纯化进行了详细研究。
1原材料、试剂
本实验室所得未经醇沉的天麻多糖粗提液[4];乙醇、氯仿、正丁醇均为成都市科龙化工试剂厂出品(分析纯AR);凝胶Sepharose 6 Fast Flow、Sephacryl-S300均为Amersham公司出品;牛血清白蛋白(中国医药上海化学试剂公司生产),考马斯亮兰G-250(中国医药上海化学试);胰蛋白酶(上海化学试剂公司)。
2试验方法
2.1蛋白质浓度测定
称取牛血清白蛋白22mg,置10mL容量瓶中,加水溶解后稀释至刻度制成贮备液。分别吸取贮备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,加水稀释至1mL,向各管中加入5mL考马斯亮兰G-250溶液,混合均匀后,在30℃下水浴加热5min,以蒸馏水为空白,在595nm波长处测定吸光度,得回归方程为:Y=303.54x-1.983,相关系数:r=0.999,呈良好的线性关系。
2.2天麻多糖除蛋白处理
天麻多糖脱蛋白的目的是除去其中的游离蛋白,而对其中糖含量有无影响是该工艺必须考虑的问题。本实验采用了Sevage法和酶+Sevage法来去除蛋白质。根据正交实验结果采取最优化条件浸提天麻粗粉,得到的粗提液浓缩备用。
2.3凝胶柱层析
本文采用Sepharose 6 Fast Flow 凝胶,Sepharose 6 Fast Flow需要手动装柱。本文对Sepharose 6 Fast Flow凝胶的分离因素(样品体积、样品浓度、洗脱速度)进行了试验,得出最佳分离条件。
3结果与讨论
3.1Sevag法脱蛋白
糖含量随着脱蛋白次数的增加而减少。经过1次-4次脱蛋白处理的天麻多糖中含糖量与其他几次处理的含糖量存在极显著差异,而经过7次脱蛋白处理与经过11次脱蛋白处理糖含量无显著差异。不同次数脱蛋白处理间天麻多糖中糖量损失的程度不同,基本上呈递减趋势,但经过前4次脱蛋白处理后天麻多糖中糖量损失最大,占所有损失量的86.9%。脱蛋白次数超过8次,糖含量变化不大。
蛋白质含量随着脱蛋白次数的增加而减少,但减少幅度并不大,经过8次脱蛋白后天麻多糖中蛋白质含量减少了95.12%,脱蛋白的效果主要在前5次,天麻前5次脱蛋白量占总量的81.99%。采用Sevag法要将天麻多糖的蛋白质除尽,至少需要8次。
3.2酶法脱蛋白
酶法脱蛋白后,剩余蛋白质含量最少的效果最好,从上面的试验结果可知4、5、6号的蛋白质吸光度比较小(见表1),根据标准曲线可算出蛋白质浓度,由上表的多糖液体积可知,编号4的脱蛋白效果最好。
3.3酶法+Sevag法脱蛋白
利用蛋白酶降解+Sevag法除蛋白,由于酶的降解作用,使得蛋白质被酶切成小肽段,处于水溶解性较好的状态,这些小肽段用Sevag法不能沉淀出来。醇沉后,小肽段处于溶解状态被除去。酶解结合一次Sevag法再醇沉后,蛋白脱出率为76.8%,(多糖含量/蛋白含量)值达到4.24,效果比较理想,减少了后续有机溶剂除蛋白的次数,降低了多糖随凝胶物沉淀而损失的可能,多糖的得率提高。但是酶解结合Sevag法步骤繁多,工作强度较大;如采用效果较好得进口蛋白酶,成本较高。
表2酶法结合法脱蛋白结果
酶解前 酶解一次Sevag法后 醇沉后
蛋白质含量(mg/ml) 1.25 0.75 0.29
蛋白质除率(%) _ 40.0 76.8
多糖含量(mg/ml) 2.60 1.66 1.23
(多糖量/蛋白质量)值 2.08 2.21 4.24
3.4Sepharose 6 Fast Flow分离
3.4.1样品体积对分辨率的影响
样品体积是由柱长和欲分离物质所允许的分辨力来决定的。制备分离的样品体积较大,为床体积的25%-30%,分级分离时样品体积要小,一般为床体积的1%-4%。样品体积必须小于分离体积才能得到较好的分离效果。本试验分别以6、8、10、12ml样品体积上柱进行试验。
当样品体积增加时,多糖的得率就随之增大,但当加样量超过10ml(占柱体积的5%)时,峰形变宽,分离效果差,说明样品量已超过凝胶柱的分离能力,所以采用Sepharose 6 Fast Flow凝胶进行分级分离时,样品体积应小于柱体积的5%。
3.4.2样品浓度对分辨率的影响
天麻多糖的浓度与粘度相关,浓度越大、粘度越大。样品溶液的粘度对分离效果影响很大,所有在凝胶层析时,必须严格控制样品溶液的浓度,一般浓度在5%左右。本论文以样品溶液浓度3%、4%、6%进行试验5。
随着样品浓度增高,洗脱峰的峰形变宽不规则。当样品浓度为6%时,两个组分根本分不开,无法进行分离。样品的浓度增加,必然造成在柱内的流动速度减慢,导致拖尾使峰形变宽,分离效果不好。但是浓度也不是越小越好。样品浓度小,每次纯化的样品量较小,根据试验结果,我们选取浓度4%进行分离。
3.4.3洗脱剂流速对分辨率的影响
在凝胶层析时,洗脱剂流速是分离效果的主要影响因素之一。本论文以洗脱剂流速0.8ml/min、1.2ml/min、1.6ml/min进行试验。速度过快,凝胶来不及和多糖分子作用,起不到分离的效果,选用0.8ml/min的流速,能将天麻多糖很好的分开。
3.4.4最适条件下分分离
从上面的试验可知,进样体积8ml、样品浓度4%、流速0.8ml/min时,Sepharose 6 Fast Flow凝胶分离效果最好。
4结论
本文系统的进行了天麻粗多糖原料液的脱蛋白工艺研究。试验结果表明:Sevag法虽然条件温和,但效率不高,一般要重复8次左右,方能去尽蛋白质;采用酶法除蛋白效果比较理想,一次就能达到比较好的效果,减少多糖损失,节约试剂用量,酶解结合一次Sevag法再醇沉后,蛋白脱出率为76.8%,(多糖含量/蛋白含量)值达到4.24;对Sepharose 6 Fast Flow凝胶的分离工艺进行了优化:进样体积8ml、样品浓度4%、流速0.8ml/min时,Sepharose 6 Fast Flow凝胶分离效果最好,峰形对称,无大的拖尾。
参考文献
[1] 张艳萍,蒋家新.多糖化合物的研究进展[J].粮油食品科技,2004,6(12):12-13.
[2] 刘成梅.天然产物有效成分的分离与应用[M].北京:化学工业出版社,2003:283-285.
[3] Hostettmann K,Marston A,赵维民,等.制备色谱技术-在天然大分子物分离中的应用[M].科学出版社,2000,256.
[4] 朱晓霞,罗学刚.天麻多糖提取工艺优化[J].时珍国医国药,2007,18(4):906-907.
