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[摘要] 目的:采用正交设计法对银杏叶黄酮类化合物提取工艺参数进行优化。方法:通过以分光光度法测定黄酮含量为指标,以固液比、提取温度、浸取剂pH值为考察因素,采用正交试验优选最佳提取工艺。结果:最佳提取工艺为固液比1∶15、提取温度70℃、浸取剂pH值为8。结论:该工艺稳定、合理、可行,适用于工业化生产。
[关键词] 正交设计;银杏叶;黄酮类化合物;提取工艺
[中图分类号] R284.2[文献标识码]C[文章编号]1674-4721(2010)06(a)-134-02
Optimization of the extration of technology of the flavonoids from leaves of Ginkgo biloba by orthogonal design
CHEN Dengfeng1, LI Liehui2, LUO Maoyu3
(1. The People"s Hospital of Nanping, Fujian Province, Nanping 353000, China; 2. Shouning County Hospital, Fujian Province, Shouning 355500, China;3. The First Hospital in Subsidiary Longyan of Medical University in Fujian, Longyan 364000, China)
[Abstract] Objective: To optimize the parameters of the flavonoids from leaves of Ginkgo biloba by orthogonal design. Methods: The extraction technology was optimized by orthogonal experiment with the content of flavonoids which was determined by spectrophotometry, and it was indexes while with ratio of solid to liquid, leaching temperature and pH. Results: The optimal extraction technology was as follow: the ratio of solid to liquid was 1∶15, leaching temperature was 70℃ and pH was 8. Conclusion: This extraction technology is stable, reasonable and feasible, and it is applicable for experimental studies.
[Key words] Orthogonal design; Leaves of Ginkgo biloba; Flavonoids; Technology on extract
银杏叶为银杏科植物银杏的干燥叶,其主要化学成分为黄酮类和萜内酯类化合物。银杏黄酮类化合物可以扩张血管,增加冠状动脉及脑血管流量,降低血黏度,改善微循环,是治疗心脑血管疾病的有效药物。萜内酯是血小板活化因子(PAF)受体特异性拮抗剂[1]。银杏叶中黄酮类化合物的提取率直接决定银杏叶的药用价值,因而银杏叶的提取工艺已成为国内外的研究热点[2-6]。本文以银杏总黄酮的提取率为指标对银杏叶提取物的提取和精制工艺进行研究,根据实际生产条件,采用70%乙醇为提取剂,对影响浸取的主要因素进行了研究,旨在提高银杏总黄酮的提取率及产品的质量。
1材料与方法
1.1 仪器与试剂
紫外分光光度计:UV-2540(岛津)紫外分光光度计;芦丁(化学对照品)批号:080-9303,中国药品生物制品检定所提供;乙醇、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠等试剂均为AR级。
1.2 实验方法
1.2.1 银杏总黄酮含量测定参照文献[7],采用分光光度法。
1.2.2 对照品溶液的制备精密称取经105℃干燥至恒重的芦丁对照品10.5 mg,置50 ml量瓶中,加70%乙醇适量,置水浴箱上微热使其溶解,放置冷却,加70%乙醇定容至50 ml,摇匀,即得(每毫升中含无水芦丁0.21 mg)。
1.2.3 空白对照溶液的制备取20 ml量瓶,加5%亚硝酸钠溶液1 ml,混匀,放置6 min,加10%硝酸铝溶液1 ml,摇匀,放置6 min,加10%氢氧化钠试液10 ml,再加水定容至25 ml,摇匀,放置15 min。
1.2.4 测定波长的确定取对照品溶液2.5 ml置25 ml量瓶中,加水至6.0 ml,加5%亚硝酸钠溶液1 ml,混匀,放置6 min,加10%硝酸铝溶液1 ml,摇匀,放置6 min,加10%氢氧化钠试液10 ml,再加水定容至25 ml,摇匀,放置15 min,以相应试剂为空白对照,按照紫外-可见分光光度法(中国药典2010版一部附录ⅤA),于400～600 nm波长范围内扫描,结果在510 nm处有最大吸收。
1.2.5 标准曲线的制备精密量取芦丁对照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 ml分别置25 ml量瓶中,各加水至6.0 ml,加5%亚硝酸钠溶液1 ml,混匀,放置6 min,加10%硝酸铝溶液1 ml,摇匀,放置6 min,加10%氢氧化钠试液10 ml,再加水至刻度,摇匀,放置15 min,以相应试剂为空白对照,按照紫外-可见分光光度法(中国药典2010版一部附录ⅤA),在510 nm波长处测吸光度,以吸光度(A)为纵坐标,溶液浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线。得回归方程:A=36.14C+0.0023,r=0.999 9,提示,芦丁浓度与吸收度在0.002 4～0.042 0 mg/ml范围内符合比尔定律,有良好的线性关系。
1.3 方法学考察
稳定性试验:取样品溶液,每隔0.5 h测定紫外吸收度,6次测定芦丁吸收度的RSD为0.17%,表明样品溶液在3 h内基本稳定。精密度试验:取同一样品溶液,反复测定5次,RSD为0,表明仪器精密度良好。重现性试验:分别取同一批号的样品4 ml,共6份,照测定方法操作,结果平均含芦丁 39.68 mg/g,RSD为2.36%。加样回收率试验:取25 ml量瓶7只,1～6号中分别精密加入对照品溶液0.5 ml,2～7号中分别加样品液4 ml,1~7号中均加5%亚硝酸钠溶液1 ml,混匀,放置6 min,加10%硝酸铝溶液1 ml,摇匀,放置6 min,加10%氢氧化钠试液10 ml,再加水至刻度,摇匀,放置15 min,以相应试剂为空白对照,在510 nm波长处测吸光度,n=5,结果平均回收率为100.27%(RSD=1.22%)。
1.4 测定方法
称取干燥并粉碎的银杏叶10.0 g,置于回流冷凝装置中,加入一定量的70%乙醇,在一定温度和pH条件下浸取3 h,滤取浸提液后适当浓缩并用70%乙醇定容至100 ml,摇匀。精密量取10 ml,置100 ml量瓶中,加水定容至100 ml,摇匀。精密量取3 ml,置25 ml量瓶中,照标准曲线制备项下的方法,自“加水至6.0 ml”起,依法测定吸光度,从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的重量,计算,即得。本品按干燥品计算,含总黄酮以芦丁计。
1.5 提取次数确定
称取干燥并粉碎的银杏叶10.0 g,置于回流冷凝装置中,每次加入70%乙醇100 ml,70℃浸取4次,每次3 h,滤取浸提液后分别测定总黄酮含量,第1、2、3、4次结果分别为53.36、25.80、9.40、6.52 mg/g。从以上实验结果可知,前3次总黄酮含量总和占4次总量的93.14%,据此,提取次数可确定为3次。
2 结果
2.1 实验结果
根据银杏叶主要化学成分性质、预试验的结果及生产实际,确定银杏叶的提取溶剂为70%乙醇。对影响醇提取工艺的主要因素(A代表固液比、B代表提取温度、C代表浸取剂pH值)按三因素三水平进行L9(34)正交试验,以提取液中总黄酮含量为评价指标,实验结果采用直观分析法和方差分析法综合评价。各因素水平安排见表1,正交试验结果见表2,方差分析见表3。
从表2直观分析可知,以总黄酮含量为指标,极差(R)最大的为A因素,对总黄酮含量影响排序是:A>B>C;同时表3方差分析显示,A因素对总黄酮含量具有显著性影响。由各因素水平的高低选取最佳提取工艺条件是A3B3C1,即固液比1∶15、提取温度70℃、浸取剂pH值为8。浸取剂pH值对浸取率影响最小,但从实验结果明显可知,pH值为8时浸取率较高,结合黄酮类化合物结构分析,大多数黄酮及其苷具有酚羟基,为弱酸性化合物,因此它们在碱性溶剂中溶解度增大,可选用弱碱性浸取剂提取黄酮类化合物。
2.2 验证试验
根据正交试验结果最终确定的提取方案A3B3C1,进行重复3次放大试验,每次称取银杏叶100.0 g,70%乙醇1 500 ml分3次(700、400、400 ml)浸提,每次3 h,提取温度70℃、pH值为8,按1.4测定法,测定总黄酮含量。结果3批样品含量分别为102.26、103.45、104.37 mg/g。表明按上述工艺提取的总黄酮含量较高,并且稳定,该工艺稳定可行。
3 讨论
结合生产实际,乙醇法提取银杏叶黄酮的优化条件为70%乙醇固液比1∶15、提取温度70℃、浸取剂pH值为8,提取3次,每次3 h。此工艺操作简便,提取全过程使用溶剂对环境无污染,使用的乙醇可回收蒸馏后重复使用,故提取成本较低,适宜于工业化生产。
[参考文献]
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[4]王平,陈丹龙,朱兴一,等.闪式提取银杏叶中萜类内酯的工艺研究[J]. 时珍国医国药,2009,20(11):2825-2826.
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[6]王晓,廖克俭,戴跃玲.银杏叶有效成分提取工艺研究[J].东华理工学院学报,2007,30 (2):181-184.
[7]国家药典委员会.中国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010:333.
(收稿日期:2010-04-13)
