【www.zhangdahai.com--开题报告】
[摘要] 目的 制备抗sHLA-Ⅰ免疫磁珠去除红细胞悬液和机采血小板中的sHLA-Ⅰ分子。方法 将单克隆抗体W6/32以共价偶联的方式包被制备免疫磁珠，以FITC标记的羊抗鼠二抗标记磁珠，用流式细胞仪鉴定包被效果。取10例红细胞悬液和机采血小板上清和制备好的免疫磁珠孵育后移去磁珠，用ELISA检测吸附前后sHLA-Ⅰ浓度变化评价吸附效果。结果 制备的抗sHLA-Ⅰ免疫磁珠包被效率约为75%。对红细胞悬液和机采血小板中sHLA-Ⅰ的吸附效果可达到84%和83%。 结论 采用单克隆抗体W6/32制备的免疫磁珠能有效去除红细胞悬液和机采血小板中的sHLA-Ⅰ分子，在改善临床输血安全方面有广阔的应用前景。
[关键词]可溶性组织相容性抗原Ⅰ类分子；免疫磁珠
[中图分类号] R392.33 [文献标识码]B[文章编号] 1673-9701（2011）19-149-02
The Preparation and Appreciation of Anti-sHLA-I Immune Magnetic Bead
YAN Shaorong1 LI Qiang1 YU Shifang2
1. Department of Clinical Laboratory，Ruian City People’s Hospital，Ruian 325200，China；2.Blood Bank，First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000，China
[Abstract] Objective To prepare anti-soluble human leukocyte antigens I （sHLA-I） immune magnetic bead for adsorbing and removing the soluble HLA �I of red cell suspension and machine adopting platelet. MethodsThe magnetic beads are coated with monoclonal antibody W6/32 by covalence coupling’s way. Then the magnetic beads are marked by the sheep-anti-mouse second antibody marked by FITC and are appraised the coating effect by flow cytometer（FCM）. Ten example red cell suspension and machine adopting platelet supernatant are selected and incubated with the prepared immune magnetic bead. Then the beads are removed from the mixed liquor and the density of the sHLA-I in the supernatant is detected by ELISA to compare the density change before and after adsorbing and appreciate the adsorbing effects. Results The prepared anti-sHLA-I magnetic beads’coating efficiency is 75%.The adsorbing effect to soluble HLA-I existing in red cell suspension and machine adopting platelet respectively is 84% and 83%. Conclusion The magnetic beads prepared with monoclonal antibody W6/32 can adsorb and remove efficiently the soluble HLA-I existing in red cell suspension and machine adopting platelet，which will have extensively appliedperspective in improving clinical transfusing blood safe.
[Key words] Soluble human leukocyte antigens I （HLA-I）； Immune magnetic bead
储存血上清中含有高浓度的可溶性组织相容性抗原Ⅰ类分子sHLA-Ⅰ，研究表明可溶性组织相容性抗原Ⅰ类分子sHLA-Ⅰ与受血者免疫功能抑制（Transfusion-related immunomodμLation，TRIM）的发生密切相关[1]，常规的白细胞过滤技术无法有效地去除储存血中的sHLA-Ⅰ，笔者尝试采用制备抗sHLA-Ⅰ免疫磁珠以特异性地吸附去除储存血中的sHLA-Ⅰ分子，现报道如下。
1材料与方法
1.1试剂
抗HLA单克隆抗体W6/32（货号：ab23755，abcam公司），免疫磁珠（货号：PM3-008，上海奥润纳新材料有限公司），FITC标记的羊抗鼠二抗（solarbio），1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺（EDC，SIGMA），N-羟基丁二酰亚胺（NHS，SIGMA），吗啉-乙磺酸（MES，SIGMA），Human HLA-1 ELISA Kit（美国R&D Systems Inc）。
1.2仪器
奥磁多功能磁分离器（货号：MS-12，上海奥润纳新材料有限公司），流式细胞仪（Cytomics FC500 MPL，Beckman CoulterInc），低温离心机（Scientific Sorvall Legend Micro 17R，thermo），恒温振荡培养箱（HZQ-X100，太仓市实验设备厂）。
1.3 储存血标本
随机选取温州市中心血站提供的贮存红细胞（RBC，10例）和机采血小板（PLT，10例）。
1.4方法
1.4.1EDC和NHS活化磁珠 取2mgPM3-008磁珠到1.5mL离心管中，用500μLMEST（10Mm MES，pH6.0，0.05%TWEEN 20）洗涤两次，磁分离后移除上清；加入200μL新配制的EDC（5mg/mL）和200μLNHS（5mg/mL）溶液到装有PM3-008磁珠的离心管中，涡旋混匀使磁珠充分悬浮，置于恒温振荡培养箱中37℃活化30min，进行混匀；离心管置于磁分离架上进行磁分离，移除上清，加入500μL BST（5mm boric acid，0.05% tween 20，ph9.0），将磁珠转移到新的离心管中；离心管置于磁分离架上进行磁分离，移除上清，磁珠用500μL BST 洗涤两次，磁分离，移除上清；经过上述步骤之后，PM3-008磁珠表面的羧基已经活化，可以与带有伯胺基的生物配体进行共价偶联。
1.4.2 抗HLA单克隆抗体W6/32的共价偶联 加入20μg生物配体到上述离心管中，用BST溶液调节总体积至500μL，轻柔混匀磁珠和生物配体；37℃偶联至少3h，该期间保持磁珠的悬浮状态；离心管置于磁分离架上进行磁分离，移除上清，加入1mL BST（含1% BSA）重悬磁珠，置于恒温振荡培养箱中37℃活化30min，进行混匀；离心管置于磁分离架上分离磁珠，移除上清，磁珠用500μL BST洗涤4次；磁分离，移除上清，磁珠用1mL BST（含0.02%NaN3，0.5%BSA）重悬，保存于4℃。
1.4.3 流式细胞仪鉴定免疫磁珠包被效果取100μL偶联好的免疫磁珠，以FITC标记的羊抗鼠二抗进行标记，置于恒温振荡培养箱中37℃孵育30min，离心管置于磁分离架上进行磁分离，PBS洗涤2次，以500μL PBS重悬，流式细胞仪鉴定免疫磁珠包被效果。
1.4.4 免疫磁珠吸附去除效果评价储存血样本12000r/min离心5min，留取一部分血浆采用ELISA检测去吸附前sHLA-Ⅰ含量。再取500μL的血浆，加入50μL制备的偶联好的免疫磁珠，置于恒温振荡培养箱中37℃孵育30min，离心管置于磁分离架上进行磁分离，ELISA检测吸附后sHLA-Ⅰ浓度，操作过程按试剂盒说明进行。
1.5 统计学分析
样本均数采用（χ±s）表示，样本间比较采用t检验，统计分析采用SPSS13.0软件处理。
2结果
2.1 免疫磁珠偶联效果
见图1。图1结果显示采用上述方法制备的抗sHLA-Ⅰ免疫磁珠的抗体包被效率约为75%。
2.2 免疫磁珠吸附效果评价
ELISA检测吸附前后储存血血浆中sHLA-Ⅰ浓度比较见表1。表1显示，贮存红细胞RBC和机采血小板PLT经免疫磁珠吸附前后血浆部分中sHLA-I含量比较有显著性差异（P＜0.05）。
3讨论
同种异体输血造成受血者免疫功能抑制[2]，导致肿瘤复发率和术后感染率增高的机制目前尚不清楚，但大量的研究表明供血者的白细胞在其中起着相当关键的作用。临床研究发现，输注用滤网去除白细胞的同种异体血液可以显著降低受血者的死亡率，减少输血后发热和抗生素的应用，并且同自体输血所造成的术后感染率和肿瘤复发率无统计学差异[3]。另一些学者[4]研究表明单纯输注去除白膜的红细胞的患者术后感染率与输注全血的患者术后感染率无统计学差异，提示血液中的其他成分中也可引起受血者免疫功能抑制。
Gluo[5]研究发现储存30d的红细胞悬液和随机采集的血小板中的可溶性HLA-1 （sHLA-I）类分子浓度显著高于其他血液成分中的sHLA-Ⅰ分子浓度。sHLA-Ⅰ类分子可以与CD8＋CTL细胞膜表面的TCR结合，阻碍了TCR特异性识别靶细胞膜上的sHLA-Ⅰ类分子――抗原复合物，从而阻碍了CTL的活化；sHLA-Ⅰ类分子还可能阻碍活化的CTL与靶细胞结合发挥效应[6-7]。
临床输注血液中sHLA-Ⅰ分子主要是储存过程中从白细胞表面脱落下来的，成分输血中血小板上清中的sHLA-Ⅰ则是由血小板降解所产生的。考虑到当前的血液制品减白技术并不能完全去除白细胞，目前我国采用的储存后（dockable filtration）减白法无法减少sHLA-Ⅰ分子等可溶性分子的产生，即使在储存前（in-line或dockable filtration）减白因为血液制品中血小板的降解也无法避免sHLA-Ⅰ分子的产生；因此如何去除血液制品中sHLA-Ⅰ分子就成为当前输血后免疫抑制研究中所面临的关键问题。本研究采用抗HLA单克隆抗体W6/32制备的免疫磁珠能够有效地吸附去除红细胞悬液和机采血小板中的可溶性HLA分子，在改善临床输血安全方面有着广阔的应用前景。
[参考文献]
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（收稿日期：2011-05-31）
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