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【摘要】 目的 探讨预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠行为学的影响。方法 ①采用序贯法测定预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠镇痛作用的ED50值;② 预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠痛行为学的影响;③运用免疫组化技术观察新斯的明对脊髓背角c-fos基因表达的影响。结果 ①预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠镇痛作用的ED50值为8.36 μg,95%可信区间为 6.68～10.70 μg;②手术组大鼠累积疼痛评分明显高于F组,预先IT新斯的明可明显降低术后疼痛引起的累积疼痛评分;③与S组相比,新斯的明ED50量明显抑制c-fos蛋白的表达, 作用主要产生在Ⅰ～Ⅱ层、Ⅴ～Ⅵ层,以Ⅰ～Ⅱ层分布最多。结论 ①预先新斯的明5～15μg鞘内应用可产生剂量依赖性的抗伤害作用;②预先鞘内注射新斯的明的抗伤害作用与抑制c-fos蛋白的表达有关。
【关键词】 新斯的明; 鞘内注射 ;切口疼痛模型; C-Fos基因
The effect of preemptive intrathecal neostigmine on a rat model of postoperative pain
GUO Yun-he.
Surgery Department,Medical College of Datong University,Shanxi 037009,China
【Abstract】 Objective To investigate the effect of preemptive intrathecal neostigmingin a rat model of postoperative pain. Methods ①Investigation of the ED50(median effective dose)value of antinociception of preemptive intrathecal neostigming by Dixon’s up and down method in a rat model of postoperative pain;②the efect of preemptive intratheca1 neostigming on the nociceptive behaviorsin rats of postoperative pain;②immunohistochemistry technique was involved in observing c-fos protein expression at spinal level.Results ①The ED50 value of antinociception of preemptive intrathecal neostigming in the rat of model of postoperative pain was 8.36 μg,CI (6.68~10.70) μg;②the cumulative pain scores of rats in operation group were much higher than those ofF-operation rats and preemptive intrathecal neostigming decreased cumulative pain scores significantly;③whenneostigming were used at the dose of ED50, they could significantly repress the expression of c-fos protein. Their functional positions were at the Layer Ⅰ-Ⅱ and Ⅴ-Ⅵ.Conclusions Preemptive intrathecal neostigming at the dose of 1 to 10 μg can produce dose-dependant antinociception;②the antinociceptive effects of preemptive intrathecal neostigmine are mediated partly by inhibition of c-fos protein.
【Key words】 Neostigming;Intrathal injection ;Postoperative pain rats ;C-Fos protein
作者单位:037009山西大同大学医学院外科教研室
新斯的明(NEO)是一种胆碱酯酶抑制剂,近几年实验和临床研究均显示鞘内(IT)NEO具有明显的抗伤害作用和镇痛作用[1]。本研究探讨预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠行为学的影响,为进一步研究提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂 新斯的明注射液(Neostigmine上海信谊金朱药业有限公司);羊抗兔c-fos多克隆抗体、PV-6001试剂盒、DAB显色剂 (北京中杉金桥生物技术有限公司);异氟醚(isoflurane,Rhone-Poulenc);麻醉机(Dragen),鞘内置管,体质量250~300 g的雄性SD大鼠,由山西医科大学实验动物中心提供。以5%的水合氯醛0.6 ml/100 kg腹腔注射麻醉后,按杨建平法[2]在大鼠蛛网膜下腔植入PE10聚乙烯导管(实验药物均经所埋导管注入蛛网膜下腔),妥善固定,术毕给予20 g/L利多卡因注射液20 μl。凡是10 s内两后肢不能负重、拖地以及针刺小腿无回缩等逃避反应,16～20 min以后又恢复负重者为实验动物,饲养5 d后用于实验。
1.2 切口疼痛模型的建立 大鼠吸入1.4%异氟醚麻醉后,将其左后爪进行消毒,按Brerman等[3] 法从足底近端0.5 cm处向趾部作一长约1 cm的切口。切开皮肤,用眼科镊挑起足底肌肉并纵向切割,保持肌肉的起止及附着完整,按压止血,用细线缝合皮肤共两针即成切口疼痛模型。
1.3 行为学实验 采用累积疼痛评分法[3]评定疼痛强度,待大鼠手术清醒后观察两后爪着地及负重情况,后爪被压迫发白表示负重,如后爪翘起不着地,记2分;如后爪着地但不负重,记1分;如后爪着地并且负重,记0分。从术后1 h起每5 min观察1次,每次1 min,以1 min内最常采取的姿势为标准,共观察1 h(1～24分),以术侧足评分减去对侧足评分即为所得累积疼痛评分。
1.4 序贯实验动物分组 根据预实验及确定的有效指标,预先鞘内给予新斯的明对切口疼痛大鼠镇痛作用的ED50值可能在5～15 μg范围,以此范围为准,采用等比系数(r)为1.316,设立5个剂量即5、6.6、8.7、11.4、15 μg,取20只大鼠用于序贯实验为新斯的明组;另有一组为生理盐水(0.9%Saline)对照组,为5只大鼠,计为S组。所有大鼠均按随机分配原则入组,而给药时采用单盲法。
1.5 c-fos检测动物分组 根据序贯实验计算出预先鞘内给予新斯的明的ED50量。取置管成功SD大鼠15只,随机分为三大组,Neo组、S组、F组。Neo组预先鞘内注射新斯的明ED50量行切口术,S组注盐水无药物,行切口术方法;F组不做手术只注盐水。组织采集和样本制备Fos表达的高峰时间为术后2 h,因此切口疼痛模型建立2 h后采用5%水合氯醛(0.6 ml/kg)麻醉,开胸,暴露心脏,经左心室灌流固定。先用200 ml 0.9%生理盐水快速灌流冲洗血液,继以4%多聚甲醛500 ml(0.1 mol/L磷酸盐缓冲液,pH 7.4)持续灌注1 h左右,接着灌入300 ml的20%蔗糖和0.1 mol/L磷酸盐缓冲液的混合液。剪开椎板取腰膨大处脊髓在4%多聚甲醛中后固定2 h,而后放人20%的蔗糖PBS液中,置4℃冰箱过夜。冰冻冠状连续切片,片厚20μm,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤(3次,5 min/次),3%H2O2灭活内源性过氧酶37℃暖箱中孵育30 min,加一抗(c-fos抗体1�∶�800),37℃ 湿盒孵育5 h,4℃冰箱过夜滴加二抗(羊抗兔),37℃孵育1 h,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤(3次,5 min/次),DAB显色30 min,自来水充分冲洗,脱水、封固镜检,核内棕色颗粒为阳性产物,每组各有一张加PBS液替代c-fos一抗,作为免疫组化的阴性对照。
1.6 统计学方法 数据均表示为均数±标准差(x±s)。P
